活细胞纳米芯片关联解析肺癌细胞基因突变和细胞行为研究

特定基因突变可能会导致肿瘤细胞产生特殊行为，例如，超强耐药性等。在活细胞内、单细胞水平上探索基因突变与活细胞行为相关性能够为临床治疗提供更加精准可靠的参考。近日，北航课题组在知名期刊Nano Letters上发表了一篇名为“Single Living Cell Analysis Nano-platform for High-throughput Interrogation of Gene Mutation and Cellular Behavior”的研究论文，并被选为当期的内封面文章。论文开发了一种新型活细胞阵列研究平台，通过纳米电递送技术将一种可原位信号放大的Domino荧光探针高效地递送至活细胞内，在单细胞水平检测细胞内基因突变。同时芯片具备细胞寻址的功能，可实现肿瘤细胞耐药性的原位分析（图1）。在研究临床肺癌细胞样本时发现，肺癌某些基因突变细胞比例与细胞对靶向药敏感程度呈现正相关性。此平台为单细胞分析、胞内基因检测提供了一种通用方法，在指导临床精准治疗方面具有较大的应用潜力。

图1.单细胞分析纳米平台原理示意图。（a）基于微孔阵列的纳米芯片在单个活细胞中检测靶标RNA的原理。（b）Domino探针与靶标RNA结合前（OFF）后（ON）的构象变化示意图。（c）纳米芯片用于将Domino探针递送到活细胞中，并提供每个细胞的位置信息。（d）芯片分层装配示意图。

EGFR突变在肺癌基因突变中存在率最高。尽管EGFR靶向药物可有效延长患者存活期，但肿瘤细胞易产生耐药性，造成靶向药物失效。预测患者是否存在EGFR突变，并推断其肿瘤细胞对靶向药物的耐药性，在提高肺癌治疗效果中起着关键作用。作者设计了一种名为“Domino”的DNA探针。此探针利用碱基互补配对原则，通过将成对的发夹DNA序列组装形成紧密的螺旋链。与传统的分子信标相比，Domino探针被靶标RNA识别的反应速度加快了4倍，荧光信号增强了10倍。为递送此探针，作者开发了一种纳米孔电递送芯片，将Domino探针递送到位于可寻址微孔中的数百万个的肺癌细胞中，实现细胞内的EGFR基因突变检测（图2）。

图2.纳米平台检测细胞内的基因突变。（a）微孔阵列靶向L858R突变的Domino探针检测H1975细胞（EGFR L858R突变）。比例尺：50 μm。（b）纳米平台检测肺癌细胞H1975（L858R突变），HCC827（19外显子缺失突变）和A549（野生型）EGFR L858R和19外显子缺失突变的荧光图。比例尺：10 μm。（c），（d）和（e）纳米平台检测肺癌细胞H1975（c），HCC827（d）和A549（e）EGFR L858R和19外显子缺失突变的流式结果。（f）采用流式细胞仪检测的H1975，HCC827和A549细胞的突变细胞阳性率。（g）统计微孔阵列上突变细胞的阳性率。（h）SLCA纳米平台针对H1975，HCC827和A549细胞的加载效率，递送效率和细胞活率。

作者利用该平台研究了肺癌患者临床样品中单个活细胞的基因突变，揭示了EGFR突变（21外显子L858R和19外显子E746-A750缺失突变）与相应的靶向药物耐受性之间存在明显的正相关性（图3）。该工作中提出的纳米平台实现原位细胞培养，活细胞内基因探测以及时空可控的细胞行为分析。

图3.原代肿瘤细胞样品中EGFR RNA突变检测和耐药性分析。（a）纳米平台检测患者L1原代肿瘤细胞中EGFR L858R突变RNA的荧光图像。比例尺：100 μm。（b）和（c）采用纳米平台从具有EGFR L858R突变（b）或19外显子缺失突变（c）的原代肿瘤细胞样品中检测到的突变细胞阳性率。（d）和（e）分别对EGFR L858R突变（d）或19外显子缺失突变（e）的原代肿瘤细胞样品进行单细胞基因分析的qPCR结果。（f）和（g）EGFR突变靶向药物厄洛替尼和吉非替尼对EGFR L858R突变（f）或19外显子缺失突变（g）的原代肿瘤细胞的抑制作用。

来源：北京航空航天大学