定向改造信号肽提高PETase的分泌表达

英文原题：Enhanced extracellular production of IsPETase in Escherichia coli via engineering of the pelB signal peptide  

通讯作者：朱蕾蕾，中国科学院天津工业生物技术研究所; 翁云宣，北京工商大学

作者：Lixia Shi (石利霞), Haifeng Liu, Songfeng Gao, Yunxuan Weng (翁云宣), Leilei Zhu (朱蕾蕾)

聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是目前广泛使用的塑料之一，其废弃物污染已成为全球性的环境问题之一。PETase 是 2016 年 Yoshida 等从一种能“吃”PET 塑料的细菌 Ideonella sakaiensis 中分离出的一种新型 PET 水解酶，可在较为温和的条件下(30℃-40℃)将PET水解为对苯二甲酸单羟乙酯(MHET)、对苯二甲酸双羟乙酯(BHET)、 乙 二 醇(EG) 和 对 苯 二 甲 酸(TPA)等组分(图1)。然而，PET 作为一种高分子聚合物，无法进入细胞，其降解需将 PETase 分泌至胞外。提高PETase分泌效率有助于PET的高效降解。信号肽对重组蛋白的分泌表达至关重要，其主要负责将重组蛋白前体定位于细胞膜上的相应分泌途径，重组蛋白在易位过程中或易位的瞬间，信号肽被信号肽酶识别并切除，随后重组蛋白在周质空间内进行空间折叠。

本项工作首先利用Sec依赖型信号肽pelB成功实现了PETase在E.coli BL21-Gold (DE3)中的分泌表达(图1)。随后，建立信号肽pelB的随机突变文库，以4-硝基苯基乙酸酯(4-pNPA)为模型底物进行筛选，得到的多个信号肽pelB突变序列中，最佳pelB突变序列使得PETase的分泌量最高提高了约1.7倍(图2)。 

图1 PETase利用pelB信号肽在大肠杆菌中的分泌过程及降解PET示意图

图2 pelB突变体表达上清的SDS-PAGE分析和4-pNPA活力测定

图3A pelB野生序列和突变序列介导分泌得到的PETase对BHET的水解能力比较；

图3B pelB野生序列突变序列和PM3介导分泌得到的PETase对PET粉末的降解能力比较；

图3C  PET膜经pelB野生序列和突变序列PM3介导分泌得到的PETase处理后的扫描电镜结果

(a：空白对照；b：PET膜经pelB原始序列介导分泌得到的PETase处理168h；c：PET膜经pelB突变序列PM3介导分泌得到的PETase处理168h)。

作者对pelB原始序列和突变序列介导分泌的PETase进行了水解BHET和PET的对比测试。如图3所示，pelB-PM3介导分泌的PETase针对BHET、PET粉末和PET膜的总活性都要明显高于pelB-WT(原始序列)：针对BHET，PM3的MHET产量约为WT的1.7倍(图3A)；针对PET粉末，前者的水解产物(MHET和TPA)的总量是后者的2.1倍(图3B)；针对PET膜，扫描电子显微镜(SEM)(图3C)显示pelB-WT及pelB-PM3介导分泌的PETase均在PET膜表面引起了不同程度的形态变化，而PM3分泌的PETase导致PET膜表面更加粗糙，并且出现了孔洞，表明更严重的腐蚀作用。该工作表明信号肽序列中少数核苷酸的优化能够显著提高PETase的分泌表达，为PETase的高效表达提供了重要思路。

本研究的相关结果已发表于J. Agric. Food Chem.，并入选ACS Editors' Choice。本项目得到了国家重点研发计划 (No. 2018YFA0901200)、中国科学院STS项目(No. KFJ-STS-ZDTP-064) 及天津市自然科学基金项目(No. 19JCYBJC24300)的支持。

J. Agric. Food Chem. 2021, 69, 7, 2245–2252

Publication Date: February 12, 2021

https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c07469

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来源：gh_0320d0d498b4 ACS美国化学会