安徽省农科院水稻所建立筛选辅助策略提高水稻ABE单碱基编辑器效率

来源：植物科学最前沿

2019年12月1日，安徽省农业科学院水稻研究所魏鹏程研究员课题组在国际著名期刊‘Plant Biotechnology Journal’中发表了题为‘Optimizing plant adenine base editor systems by modifying the transgene selection system’的通讯短文。该研究通过建立筛选辅助系统，显著提高了水稻中ABE单碱基编辑器的效率。

作物多种关键农艺性状由SNP决定，然而精确的碱基替换是作物基因工程操作的难点。单碱基编辑工具，主要包括胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)，可高效的导入A∙T 与G∙C碱基间的颠换，在作物育种改良中具有巨大应用潜力。2018年，多个研究组均已建立了植物ABE碱基编辑系统(Hua et al., 2018; Yan et al., 2018)，但编辑效率往往不高，严重影响了该系统在作物中的利用。最近已有报道通过优化ABE各元件数量或调整TadA结构提高碱基编辑能力(Hua et al., 2019; Li et al., 2018)，但进一步的效率优化仍有重要意义。

该研究以作者前期构建的一个植物低效率ABE工具为改良对象(Li et al., 2019)，尝试利用两种筛选辅助策略提高编辑效率。1, sgRNA共表达策略（图1）。在水稻OsACC基因中，ABE导入C2186R突变可产生芳氧苯氧丙酸脂（APP）类除草剂抗性。通过共表达目标sgRNA和OsACC-C2186R sgRNA， 在APP除草剂高效氟吡甲禾灵筛选下，将富集ABE正常发挥作用的转化细胞，从而提高共表达sgRNA在目标位点的编辑效率。研究表明，在转化愈伤群体和再生植株中，该策略均能一定程度提升ABE效率。

图1. 基于抗除草剂共编辑策略的载体构成

2，ABE-HPT融合表达策略（图2）。碱基编辑器表达量直接决定效率。通过将ABE和潮霉素（Hyg）抗性基因HPT的置于单一转录翻译框中融合表达，通过Hyg筛选可富集ABE强表达细胞。在早期抗性愈伤群体中，该策略可带来～4.9倍的碱基编辑效率提升；在再生株系中，该策略可将低至12.5%的突变体频率提升至100%。此外，利用原抗性标记表达框表达正筛选标记PMI，可在T1世代通过短暂的甘露糖筛选-恢复过程完成准确的非T-DNA携带株系初筛。该研究不仅优化了作物ABE工具，所提出的策略也可广泛的用于植物其他CRISRP基因编辑系统的改进。

图2. 基于ABE-HPT融合策略的ABE工具 

安徽省农业科学院水稻所李娟副研究员、秦瑞英副研究员和博士生张原頔为论文共同第一作者；魏鹏程研究员为通讯作者。水稻所多位研究人员和中国农业大学食品学院张秀清副教授也参与了研究。研究获得国家转基因生物新品种培育重大专项支持。

参考文献：

Hua, K., Tao, X., Liang, W., Zhang, Z., Gou, R. and Zhu, J.-K. (2019) Simplified adenine base editors improve adenine base editing efficiency in rice. Plant Biotechnology Journal https://doi.org/10.1111/pbi.13244.

Hua, K., Tao, X., Yuan, F., Wang, D. and Zhu, J.-K. (2018) Precise A· T to G· C base editing in the rice genome. Molecular plant 11, 627-630.

Li, C., Zong, Y., Wang, Y., Jin, S., Zhang, D., Song, Q., Zhang, R. and Gao, C. (2018) Expanded base editing in rice and wheat using a Cas9-adenosine deaminase fusion. Genome Biology 19, 59.

Li, H., Qin, R., Liu, X., Liao, S., Xu, R., Yang, J. and Wei, P. (2019) CRISPR/Cas9-Mediated Adenine Base Editing in Rice Genome. Rice Science 26, 125-128.

Yan, F., Kuang, Y., Ren, B., Wang, J., Zhang, D., Lin, H., Yang, B., Zhou, X. and Zhou, H. (2018) Highly Efficient A·T to G·C Base Editing by Cas9n-Guided tRNA Adenosine Deaminase in Rice. Molecular plant 11, 631-634.