用Cas9/gRNA技术，揭示杨树次生细胞壁纤维素合成酶的功能

来源：植物科学最前沿

2021年3月13日，东北林业大学林木遗传育种实验室程玉祥教授团队在国际著名期刊New Phytologist发表题为“Functional understanding of secondary cell wall cellulose synthases in Populus trichocarpa via the Cas9/gRNA‐induced gene knockouts ”的研究论文。该研究使用Cas9/gRNA基因编辑方法，揭示杨树纤维素合成酶PtrCesA在富含纤维素树木中的多种功能。

研究背景

植物纤维素(CMFs)是β-1，4-葡聚糖的纤维状结晶聚合体，由质膜定位的纤维素合成酶(CesA)复合物合成。高等植物中的CesA基因家族，可以分为多级细胞壁(PCW) CesA家族和次级细胞壁(SCW)CesA家族。在拟南芥中，CesA1、CesA3和CesA6（-like）负责合成PCW纤维素，而CesA4、CesA7和CesA8负责合成SCW纤维素。但是目前对于富含纤维素的树木中，仍缺乏对次级细胞壁CesAs的整体功能性测定，尤其是基于基因敲除方面的功能性研究。

主要研究结果

（1）杨树是一种具有良好基因组注释的模式树种，拥有17个CesA基因，据报道多个杨树CesA基因参与了SCW的合成。为了研究 PtrCesAs在树木中的作用，研究者采用Cas9/gRNA基因编辑方法对PtrCesA4、7A、7B、8A和8B的功能缺失突变进行了研究。对基因表达水平分析结果显示，敲除一类PtrCesA(PtrCesA4、7A/B或8A/B)基因的表达会降低了其他两类PtrCesAs蛋白质水平。

（2）表型分析显示，PtrCesA4基因的敲除，会造成了转基因树木在生长和发育方面的严重缺陷。ptrcesa4突变体完全匍匐生长，形成扭曲的茎，且突变体完全失去顶端优势。 ptrcesa4的茎非常脆，茎的直径、节间长度、叶片大小和根系结构都明显减少，表皮细胞和保卫细胞的大小也明显变小。ptrcesa7a/b 以及 ptrcesa8a/b双突变体也表现出了类似的表型。光镜分析表明，在ptrcesa4、7a/b和8a/b突变体中茎木质部严重塌陷。上述结果表明，PtrCESA4、7A/B和8A/B在杨树生长发育中起着至关重要的、相似的和非冗余的作用。

图 杨树ptrcesa4、7a/b和8a/b突变体的表型

（3）扫描电镜结果显示，在ptrcesa4、7a/b和8a/b突变体中，除了木材纤维的严重塌陷外，木质部-I和木质部-II中还观察到很薄的一层壁纤维。进一步的透射电镜分析清楚地显示了，野生型木纤维中具有多层SCW结构，并含有可见的S1和S2层；而突变体只显示了薄薄的一层壁纤维。进一步观察显示突变体的导管细胞壁内表面有起伏和不均匀等异常。该结果表明，PtrCesA4、7A/B或8A/B的基因的缺失导致杨树纤维和导管壁结构的严重破坏。

图 透射电子显微镜(TEM)分析了ptrcesa4、7a/b和8a/b突变体的韧皮部和木质纤维壁结构

（4）为了探究PtrCesA4、7A/B和8A/B在茎韧皮部纤维壁结构中的作用，研究者使用扫描电镜和投射电镜观察了突变体细胞壁的结构。观察显示，野生型初生韧皮部和次生韧皮部纤维壁极厚，分别有多层和S+G层；而突变体的原生韧皮部和次生韧皮部纤维分别失去了n(G+L) 层和G层，并保留了较厚的S层。结合多糖免疫定位数据，发现PtrCesAs合成纤维素酶在木材和韧皮部纤维壁结构中的作用不同。 

结果和意义

本研究使用Cas9/gRNA基因编辑方法，对PtrCesA4、7A、7B、8A和8B的功能进行了详细研究。对SCW PtrCesAs的功能理解，为缺乏纤维素生物合成对树木生长、SCW、木材G纤维和韧皮部纤维壁结构的影响提供了更多的见解。

原文链接：

https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.17338?saml_referrer