eLife：贾瑞博士等报道细胞自噬调节的新机制

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细胞自噬是溶酶体（lysosome）对细胞自身物质的吞噬降解过程，在真核细胞中普遍存在。待降解的细胞内容物首先被双层膜囊泡包裹，形成自噬体（Autophagosome），随后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体（Autolysosome），最终被溶酶体中的酸性水解酶降解。通过自噬降解的细胞物质包括异常颗粒，例如蛋白质聚集体、受损的细胞器和细胞内病原体。自噬还参与正常细胞成分的降解，以保证细胞在营养缺乏或其他生存压力下存活。通过这些功能，自噬在维持细胞稳态中起着至关重要的作用。自噬功能障碍与多种疾病相关，包括退行性神经疾病，癌症，心脏病和传染性疾病。

细胞自噬涉及多个步骤，包括自噬相关信号通路的激活，吞噬泡（phagophore）的形成及延伸，底物的包裹，自噬体闭合，以及自噬体与溶酶体融合。通过在酵母细胞中的遗传学筛选，人们已经鉴定到大部分参与自噬过程的核心功能蛋白，对它们在自噬过程中的作用也有了深入的研究。然而，除核心蛋白外，细胞还通过一系列调节蛋白调控自噬活性。对于调节蛋白的鉴定及功能研究，成为当前细胞自噬领域的研究热点。

近日，美国国立卫生研究院（NationalInstitutes of Health）的贾瑞博士和Juan Bonifacino博士在eLife杂志上发表题为Negative regulationof autophagy by UBA6-BIRC6–mediated ubiquitination of LC3的研究文章（第一作者贾瑞博士）。该文首次证明细胞自噬关键因子LC3蛋白可以通过泛素-蛋白酶体途径降解，揭示了LC3分子的泛素化修饰对自噬底物的降解具有重要的调节作用。

文章作者首先采用基因编辑的方法，在人类H4神经胶质瘤细胞系中，使用串联荧光蛋白GFP-mCherry标记内源MAP1LC3B（LC3B）蛋白，建立了用于指示自噬进程的H4-tfLC3B细胞系。在未发生自噬的及含有自噬体的H4-tfLC3B细胞中，由于GFP与mCherry共同表达，细胞呈现黄色荧光；自噬溶酶体形成后，酸性的溶酶体环境使酸敏感的GFP蛋白荧光淬灭，而mCherry蛋白的荧光不受影响，进而使自噬溶酶体呈现红色荧光。因此，在自噬缺陷的H4-tfLC3B细胞中，由于生成自噬体或自噬溶酶体的过程受阻，细胞整体将表现出GFP：mCherry比值升高。利用这一特性，作者使用慢病毒全基因组CRISPR/Cas9 KO文库转导H4-tfLC3B细胞，并通过流式细胞分选（FACS）收集了GFP：mCherry比值较高的细胞，而后通过第二代DNA测序和分析鉴定到了导致该表型的sgRNA。

在众多候选蛋白中，作者主要关注于两个泛素化相关的蛋白，UBA6（ubiquitin like modifier activating enzyme 6）和BIRC6 [baculoviralIAP (inhibitor of apoptosis) repeat containing 6]（也称为BRUCE或Apollon）。此前，未有报道阐明它们在自噬过程中的作用。UBA6是人类基因组编码的八种泛素激活酶（E1）之一，它既能激活泛素又能激活类泛素蛋白UBD（也称为FAT10）。BIRC6兼具泛素结合酶（E2）和泛素连接酶（E3）活性，已有研究表明BIRC6通过催化SMAC和caspase9的泛素化和蛋白酶体降解来抑制细胞凋亡。

为了研究UBA6和BIRC6在自噬过程中的功能，作者构建了UBA6和BIRC6特异性敲除的H4细胞系。作者最初预期UBA6或BIRC6敲除可能通过抑制自噬过程的某些步骤，阻碍GFP-mCherry-LC3B向自噬溶酶体的传递，从而阻止GFP的淬灭，导致GFP:mCherry比值升高。矛盾的是，作者发现这些蛋白的敲除并没有降低自噬流，反而在营养缺乏、蛋白合成抑制或胞内蛋白聚集体形成等特殊条件下，增强了自噬流。进一步的实验证明，UBA6和BIRC6作为E1和E2/E3协同作用，介导分布于细胞浆的非脂质形式的LC3B（LC3B-I）进行单泛素化修饰和蛋白酶体降解。在普通培养条件下，UBA6或BIRC6敲除抑制LC3B的泛素化降解，提高了LC3B-I的水平，而膜结合的磷脂酰乙醇胺偶联形式的LC3B（LC3B-II）的水平没有发生变化。当细胞缺乏血清和氨基酸时，UBA6或BIRC6敲除细胞中较多的LC3B-I转化产生大量的LC3B-II，增强自噬流。此外，在用环己酰亚胺（cycloheximide）抑制蛋白质合成后，UBA6或BIRC6敲除细胞表现出自噬受体SQSTM1和NBR1的快速降解。在自噬底物降解方面，UBA6或BIRC6敲除延缓了H4细胞中嘌呤霉素诱导的ALIS（可诱导的类聚集体结构）；Birc6敲低（KD）减少了大鼠海马神经元轴突中α-synuclein聚集体的积累。

综上，本研究通过全基因组CRISPR／Cas9 KO筛选，发现新的自噬调节蛋白UBA6和BIRC6。它们通过介导LC3的泛素化降解抑制自噬的活性。降低UBA6和BIRC6表达会增强细胞自噬，减少细胞内蛋白质聚集体的积累。这一发现，为开发用于激活自噬、治疗蛋白质聚集疾病（例如各种神经退行性疾病）的药物提供基础。 

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https://elifesciences.org/articles/50034