陈玲玲组使用CRISPR-Cas13系统应用于RNA活细胞标记

来源：BioArt

原标题：Mol Cell ： 陈玲玲组使用CRISPR-Cas13系统应用于RNA活细胞标记

CRISPR-Cas系统是一类广泛存在于细菌和古细菌体内保护宿主免受外源病毒入侵的获得性免疫系统。由向导RNA (crRNA) 酶活性的Cas蛋白组成，Cas蛋白在向导RNA的作用下可以结合与向导RNA互补配对的序列，并进一步切割靶序列。根据Cas蛋白的分类和效应复合物的性质主要分为两大类Class 1和Class 2，六种不同类型。1类系统包括类型I、III、IV，效应复合物由多个Cas蛋白 (具有一个或多个内切酶活性组分) 组成并与crRNA紧密结合，相反，2类系统包括类型II、V和VI，只有一个具有内切酶活性的多结构蛋白。其中II类CRISPR-Cas系统CRISPR/Cas9系统已经被广泛用于基因敲除和敲入以及基因组标记等多种方面，极大地方便了基因操作和基因组研究。而VI类系统又叫CRISPR-Cas13系统，是向导RNA介导的RNA靶向的内切酶系统，从15年被张峰等人发现至今一共鉴定出四个亚型：VI-A(Cas13a/C2c2)，VI-B(Cas13b)，VI-C(Cas13c)和VI-D(Cas13d)，已经开始运用于RNA的敲低，RNA定点编辑，RNA检测以及RNA剪接调控。

2019年11月19日，中国科学院分子细胞科学卓越创新中心（生物化学与细胞生物学研究所）陈玲玲研究组在Molecular Cell杂志上在线发表了关于CRISPR-Cas13应用于RNA活细胞标记的最新研究进展：Dynamic imaging of RNA in living cells by CRISPR-Cas13 systems。该研究对多种CRISPR-Cas13蛋白进行酶活突变后，筛选出了具有较好RNA标记能力的dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，并且使用优化后的CRISPR-Cas13系统可以对胞浆和胞核的非编码RNA和mRNA进行有效标记。进一步联合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白实现了对活细胞内不同RNA的双色标记，与CRISPR-Cas9联用实现了对转录RNA和基因位点同时标记。

为了筛选出标记能力更好的CRISPR-Cas13蛋白，研究人员选取了来源于VI-A(Cas13a/C2c2)，VI-B(Cas13b)和VI-D(Cas13d)三个亚型的8个蛋白，对它们的RNA标记能力进行了比较，发现无论是对于细胞核的长非编码RNA NEAT1还是对于细胞浆的mRNA MUC4来说，来源于VI-B(Cas13b)的dPspCas13b和dPguCas13b都具有较好的标记能力。进一步对向导RNA (gRNA) 的研究发现，gRNA的spacer长度在20到27 nt 的长度有较好的标记效果，更长的gRNA反而会降低甚至会失去标记能力。而gRNA的在目的RNA上的靶向位置对dPspCas13b的标记能力同样有较大差异，进一步说明了RNA的结构对标记能力的影响。研究人员比较CRISPR-Cas13标记系统和传统常用的MS2-MCP系统发现，MS2-MCP标记系统因为插入的MS2重复元件而具有更强信号，但是会影响目的RNA 表达；而CRISPR-dPspCas13b对目的RNA表达没有影响。通过对NEAT1所组成的paraspeckle进行动态观察，发现CRISPR-Cas13标记系统和MS2-MCP对paraspeckles的运动能力都不会产生影响。长时间动态追踪发现paraspeckles之间可以相互融合和分裂，并提出了“hit-run/fusion”模型，解释长形paraspeckle的形成过程。为进一步实现RNA单分子水平标记，研究人员构建了一系列带有不同数目重复元件的RNA序列，发现当目的序列带有12个及以上重复元件时，通过靶向这些重复元件，dPspCas13b可以在单分子水平实现对目的RNA的标记。此外，联合dPspCas13b和dPguCas13b蛋白，研究人员实现了对同一RNA和两个不同RNA的双色标记，为研究两个RNA之间的相互关系提供了一个新的工具。此外，联合CRISPR-dCas13系统与CRISPR -dCas9系统，研究人员也实现了对基因转录的RNA和基因位点的同时标记，为研究RNA转录和RNA与基因位点的关系，提供了一个简单和便利的新手段。

图注：CRISRP-dCas13 在活细胞RNA标记上的应用。

据悉，生化与细胞所博士生杨良中与博士生王洋为共同第一作者，陈玲玲研究员为通讯作者。该研究受到了中科院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞分析技术平台，GE Healthcare Life Sciences（上海）的大力支持。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.10.024