Science ：西湖大学施一公研究组报道世界首个人源次要剪接体的电镜结构

来源：iNature

2021年1月29日，西湖大学施一公教授研究组在Science 在线发表题为“Structure of the Activated Human Minor Spliceosome”的研究论文，该研究是剪接体结构与机理研究的又一个重大突破。

该研究首次报道了迄今整体研究知之甚少的次要剪接体的高分辨率三维结构，展示了在剪接反应中的一个关键构象——激活态次要剪接体（activated minor spliceosome，定义为“次要Bact复合物”），整体分辨率高达2.9埃。该结构第一次展示了人源次要剪接体的组成、以及对稀有内含子（U12依赖型内含子）的识别机理，首次揭示了次要剪接体的催化中心以及活性位点，并且通过结构解析鉴定了次要剪接体的全新蛋白组分、揭示了它们对次要剪接体及罕见内含子剪接的重要作用等一系列重要科学问题。此次重大突破，使施一公研究组在继2015年首次解析世界上第一个剪接体结构、2017年解析第一个人源剪接体结构之后，再次成为世界上首个解析了次要剪接体高分辨率三维结构的团队。

另外，2020年12月28日，清华大学施一公团队在Cell 在线发表题为“Structural basis of γ-secretase inhibition and modulation by small molecule drugs”的研究论文，该研究报告了三种不同的GSI抑制γ分泌酶的结构机制：Semagacestat，Avagacestat和L685,458。该研究还报告了与GSM E2012结合的γ-分泌酶的原子结构，整体分辨率为2.6 –3.1Å。值得注意的是，每个GSI都在presenilin1（PS1）上占据相同的一般位置，以容纳淀粉样前体蛋白或Notch的β链，从而干扰了底物募集。L685,458直接协调PS1的两个催化天冬氨酸残基。E2012与细胞外侧γ-分泌酶的变构位点结合，可能解释了其调节活性。该研究揭示了三种不同的γ-分泌酶抑制剂的作用机理，分析了其共同点，更重要的是揭示了三者之间的区别，为未来优化和设计具有底物特异性的抑制剂奠定了坚实基础。这项研究更清楚的揭示了这些调节剂和抑制剂是怎样抑制底物进入的，为之前临床药物的失败提供了解释，也将极大地推进下一代γ-分泌酶抑制剂及调节剂的设计与优化。

2020年11月27日，西湖实验室（浙江省政府批准设立的省实验室，依托西湖大学），西湖大学，清华大学等多单位合作，施一公及万蕊雪共同通讯在Science 在线发表题为“Mechanism of spliceosome remodeling by the ATPase/helicase Prp2 and its coactivator Spp2”的研究论文，该研究报告了Prp2，共激活因子Spp2复合的Prp2和装载Prp2的活化剪接体的原子结构，以及结构指导的生化分析的结果。Prp2与剪接体弱结合，没有Spp2就无法发挥功能，而Spp2与Prp2和剪接体上的锚分子稳定缔合，从而将Prp2束缚到活化的剪接体上并允许Prp2起作用。Pre-mRNA被加载到Prp2的N-和C-半之间的特征通道中，其中N-half的Leu536和C-half的Arg844阻止了pre-mRNA向其5'端的向后滑动。ATP结合和水解触发Prp2中的域间移动，从而驱动pre-mRNA朝其3'端单向逐步转移。这些保守的机制解释了剪接体重塑与Pre-mRNA剪接的耦合。

2020年5月6日，施一公团队（清华大学为第一单位）在Cell Research 在线发表题为”Structure of the cytoplasmic ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex by cryo-electron microscopy single particle analysis“的研究论文，该研究介绍了非洲爪蟾NPC CR的单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构，平均分辨率为5.5-7.9–Å，局部分辨率达到4.5Å。改进的分辨率允许在大多数CR组件中标识和放置辅助结构元素。每个CR亚基中的两个Y复合物彼此相互作用，并与侧翼亚基的Y复合物缔合，形成圆形支架。在每个CR亚基中，含有Nup358的区域包裹着两个Y复合物的茎，可能稳定了支架。Nup205连接两个Y配合物的短臂，并与相邻Y配合物的茎相连。包含Nup214的区域使用延伸的卷曲螺旋连接两个Y络合物的Nup85，并突出到NPC的轴向孔中。这些以前没有特征的结构特征揭示了对NPC组装的了解。

2020年5月4日，施一公团队(西湖大学为第一单位)在Cell Research 在线发表题为”Molecular architecture of the luminal ring of the Xenopus laevis nuclear pore complex“的研究论文，该研究报告了非洲爪蟾卵母细胞的NPC的腔环（LR）的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）结构。LR的观察到的关键结构特征可通过单粒子低温电子显微镜（cryo-EM）分析独立确认。该研究揭示了LR以前未知的特征，并可能解释了NPC的弹性。

在高等生物中，一段又一段的遗传密码埋在核酸分子中。其中，“无效”的遗传信息不具有翻译功能，被称为内含子，而可以被核糖体翻译的有效遗传信息叫做外显子。把这些遗传密码中“无效”的内含子“剪”出来，“有效”的外显子“接”到一起的过程叫做RNA剪接，它是生命体解读遗传密码的核心步骤。负责执行这一步骤的就是细胞核内复杂精密的分子机器——剪接体。每个细胞对于每一条剪接前的基因信使——前体信使RNA的剪接在时空上是非常精准的。剪掉谁，剪掉多长，什么时候剪，按照什么顺序把外显子拼接起来，每一个“操作”都是可能改变细胞命运的关键问题。一步走错，结果千差万别，基因的表达和传递也会因此出现错误，于是就导致了人类某些先天遗传疾病以及后天疑难杂症的出现。研究发现，人类的遗传疾病大约有35%都是因为剪接异常造成的。从1977年首次发现RNA剪接至本世纪初，科学家们通过免疫沉淀、基因敲除、交联质谱、建立体外剪接反应系统等研究手段，初步建立起剪接体的组装、激活与解聚的发生过程，以及蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的相互作用、相互调控等复杂的RNA剪接调控网络。

20世纪90年代，科学家在对高等真核生物内含子序列的研究分析中，发现了一类非经典的内含子剪接序列（5’剪接位点为AT，3’剪接位点为AC），一种全新的剪接体开始逐渐进入科学家的视野。在随后的研究中，科学家们逐渐确定了这个全新剪接体的核酸组成，其中U11、U12、U4atac、U6atac四种新的snRNA参与该类内含子的识别与剪接。由于这种非经典的内含子占比不足百分之一，该类内含子被称作稀有内含子，而因其特殊的剪接位点及识别该位点的特殊snRNA组分，该类内含子又被命名为AT-AC内含子（AT-AC intron）或U12依赖型内含子（U12-type intron），催化该类内含子剪接的这种全新剪接体被命名为次要剪接体（minor spliceosome）。尽管由次要剪接体进行剪接的稀有内含子含量极低，但是这些基因却与许多重要的细胞基本生命活动密切相关，比如DNA的复制与修复、RNA转录与翻译等等。然而，对于U12依赖型内含子以及次要剪接体的研究却发展缓慢，次要剪接体的蛋白组成、重塑调控等等关键的科学问题，一直没有答案。其中非常重要的一步——如何捕获并纯化次要剪接体，是领域内面临的一个巨大难题。

施一公研究组一直致力于剪接体的三维结构与RNA剪接分子机理的研究，自2015年报道了第一个剪接体的高分辨率三维结构后，相继解析了酿酒酵母和人源主要剪接体（major spliceosome）的全部已被鉴定的基本构象。这些已解析的剪接体覆盖了整个RNA剪接循环，从分子层面揭示了剪接体催化RNA剪接两步反应的工作机理，同时为理解剪接体的组装、激活和解聚等过程的发生提供结构依据，首次将剪接体介导的RNA剪接过程完整的串联起来，为理解RNA剪接的分子机理提供了最清晰、最全面的结构信息（图2）。与此同时，施一公研究组也将目光聚焦在了研究更为匮乏的次要剪接体研究领域。

图2 施一公研究组解析的剪接体结构汇总

在没有任何次要剪接体的捕获与纯化等相关文献的情况下，摸索并建立次要剪接体的捕获与纯化方法迫在眉睫。施一公研究组的白蕊博士与万蕊雪博士，长期从事剪接体的纯化与结构研究工作，并积累了大量剪接体结构研究的经验。在此研究经验基础之上，结合次要剪接体识别位点的特异性，研究组首次设计出一条全新的U12依赖型的pre-mRNA。通过改良前人的体外剪接反应实验条件，成功地确定了该U12依赖型的pre-mRNA具有极高的特异性与剪接的高效性。由于次要剪接体的含量极低，如何进一步获得性质良好的次要剪接体样品，成为本文研究的第二大难点。白蕊和万蕊雪在原有的剪接体纯化基础之上，进一步探索与改良，最终首次建立起一套完整的次要剪接体捕获与纯化方法，成功获得了处于激活态的次要剪接体的蛋白样品，随后利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了世界上首个次要剪接体的冷冻电镜结构，整体分辨率为2.9埃，并搭建了第一个次要剪接体的原子模型，其中包含了4条RNA和45个蛋白（图3）。

图3 人源次要剪接体的三维结构

该文解析的人源次要剪接体Bact complex结构，首次观察到了次要剪接体特有组分U6atac snRNA和U12 snRNA的三维结构，揭示了识别U12-type内含子剪接位点的结构基础，第一次展示了次要剪接体活性位点和催化中心的三维结构。在次要剪接体的活性位点中，两个具有关键作用的催化镁离子被周围的RNA配位结合，为剪接反应的发生提供了基础。该结构的成功解析，首次鉴定出了5个全新的蛋白组分，它们参与组成次要剪接体因此在U12依赖型内含子的剪接中起重要作用。SCNM1、CRIPT为U12 snRNP的特有组分，参与识别和稳定内含子上的剪接位点；RBM48与ARMC7形成复合物，结合在U6atac snRNA的5’末端，结合并保护U6atac snRNA特有的γ-甲基磷酸帽结构，起到稳定U6atac snRNA构象的作用。此外，参与泛素化通路的PPIL2蛋白在剪接体中的结构首次解析，该蛋白深入次要剪接体的活性位点，与U5 snRNA有直接的相互作用，参与稳定U5 snRNP以及次要剪接体的催化中心。值得一提的是，在主要剪接体激活过程中起关键作用的“动力驱动”蛋白Prp2及其激活因子Spp2，也以类似的方式结合到次要剪接体中，这是Prp2同时也在次要剪接体中起作用的第一个支持性证据。由此不难推断，推动主要剪接体进行结构重塑的数个ATPase也参与次要剪接体不同构象之间的转变与重塑中，即次要剪接体与主要剪接体之间共享结构重塑蛋白因子（图4）。该文作为第一篇揭示人源次要剪接体的结构研究，文中建立的捕获与纯化次要剪接体的方法、鉴定的参与次要剪接体的组成的全新蛋白等，都将对U12依赖型的RNA剪接分子机理的研究产生重要影响。

图4 次要剪接体与主要剪接体的结构差异

西湖大学生命科学学院施一公教授、西湖大学生命科学学院西湖学者万蕊雪博士为本文的共同通讯作者；西湖大学生命科学学院博士后白蕊和西湖学者万蕊雪为本文的共同第一作者；清华大学生命学院博士后王琳参与了部分生化研究；清华大学生命学院博士生徐魁、清华大学生命学院张强锋研究员为结构模型的搭建提供了帮助；清华大学冷冻电镜平台主管雷建林博士为冷冻电镜数据收集提供了帮助。电镜数据采集于清华大学冷冻电镜平台，计算工作得到清华大学高性能计算平台、国家蛋白质设施实验技术中心（北京）的支持。本项研究成果来自于西湖实验室，获得了西湖教育基金会、北京结构生物学高精尖创新中心（清华）及国家自然科学基金委的经费支持。