来源:植物生物学
溶液配制:
Honda buffer:
25 mM Tris-HCl(pH7.4)
10 mM MgCl2
2.5% (wt/vol) Ficoll 400
5% (wt/vol) Dextran T 40
0.4 M蔗糖
1x Protease Inhibitor Cocktail (用前加)
5 mM DTT (用前加)
10 mM β-巯基乙醇 (用前加)
Triton X-100:20% (vol/vol)
试剂及耗材:
Triton X-100:#T8787, Sigma, St. Louis, USA
蛋白酶抑制剂(cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets): #11836145001, Roche, Mannheim, Germany
二硫苏糖醇(DL-dithiothreitol, DTT): AMRESCO, Solon, USA
Ficoll 400: #F4375,Sigma,St. Louis,USA
Dextran T40: #17-0270-01, GE Healthcare, Little Chalfont, England
UGPase抗体: #AS05086, Agrisera, Vännäs, Sweden
Histone H3抗体: #AS10710, Agrisera, Vännäs, Sweden
Miracloth滤布: #475855-1R,Calbiochem, Merck Millipore, Darmstadt, Germany
实验流程:
1. 称取2 g 10日龄的拟南芥幼苗于液氮中研磨。
2. 将样品转移至预冷的离心管中,并加入4 mL Honda buffer,颠倒混匀后置于冰上10 min,使其充分溶解。
3. 用Miracloth滤布对样品进行过滤。
4. 在滤液中加入终浓度为0.5%的Triton X-100。充分混匀后冰上放置15 min。
5. 取出100 μL样品作为总蛋白(Total protein)。
6. 4℃,离心1500 g,5 min。转移上清至新管,作为去除了核的细胞质组分蛋白(Nuclei-depleted fraction)。再重复离心2次,去除沉淀。
7. 沉淀用1 mL添加了0.1% Triton X-100的Honda buffer进行清洗,洗5次,1500 g,离心5 min。
8. 沉淀用Honda buffer重悬,50 g,离心1 min,以去除细胞碎片,细胞壁及淀粉粒等组分。并将上清转移至新的离心管。
9. 1800 g,离心5 min,收集的沉淀即为核组分(Nuclei-enriched fraction)。将沉淀溶于100 μL Honda buffer中。
10. 将总蛋白、胞质组分和核组分进行SDS-PAGE电泳及Western blot检测分离效果。
11. Western blot所用抗体:细胞质组分特异的UGPase抗体(1 : 500稀释)及核组分特异的Histone H3抗体(1 :5000稀释)对同时对各组分进行检测。
结果示例:
引自ref.3
参考文献:
1. Kinkema et al., Nuclear Localization of NPR1 Is Required for Activation of PRGene Expression, The Plant Cell (2020) 12:2339–235
2.Xia et al., Developmental and hormonal regulation of the Arabidopsis CER2 gene that codes for a nuclear-localized protein required for the normal accumulation of cuticular caxes, Plant Physiology (1997) 115:925-937
3. Long et al., BICELLULAR POLLEN 1 is a modulator of DNA replication and pollen development in Arabidopsis, New Phytologist (2019) 222: 588–603
来源:PlantBiotech 植物生物学
原文链接:http://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI5NTk2MTcyOA==&mid=2247494835&idx=5&sn=2f1cb5cd0f936b9f715cb8c6d6c9967b
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