合成糖脂用于鉴定分枝杆菌中阿拉伯半乳聚糖的支链结构

来源：ACS美国化学会

大家好，今天为大家介绍一篇ACS Chem. Biol.文章，题目为“Use of Synthetic Glycolipids to Probe the Number and Position of Arabinan Chains on Mycobacterial Arabinogalactan”。本文的通讯作者是来自科罗拉多州立大学的Mary Jackson。本文中，作者合成了一系列长度不同的聚半乳糖，通过鉴定该聚糖与阿拉伯糖基供体的在α-(1→5)-阿拉伯糖基转移酶(AftA)作用下的反应产物，证明了体外实验中AftA能够特异性地对第六个半乳糖单体进行阿拉伯糖基化修饰。

阿拉伯半乳聚糖(AG)是分枝杆菌细胞壁的主要组成成分，在组成与维持细胞壁功能中发挥着重要的作用。AG的具体结构包括衔接双糖、聚半乳糖以及聚阿拉伯糖三部分，在谷氨酸棒状杆菌中，阿拉伯聚聚糖可与聚半乳糖上三个不同位置的半乳糖单体发生反应从而形成阿拉伯半乳聚糖(图1)。在AG的生物合成途径中， AftA能够将第一个阿拉伯糖基修饰到聚半乳糖上，而分枝杆菌中AftA在聚半乳糖上修饰阿拉伯糖基的位置及数目尚未被阐明。基于此，作者通过体外合成一系列长度不同的聚半乳糖，与阿拉伯糖基供体及高表达AftA的耻垢分枝杆菌细胞膜反应，从而对AftA在聚半乳糖上修饰单一阿拉伯糖基的位置及数目进行了鉴定。

图1. 真菌中聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖复合物及体外合成的聚半乳糖、阿拉伯糖基供体结构示意图。A.谷氨酸棒状杆菌中聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖复合物结构；B.体外合成聚半乳糖结构；C.阿拉伯糖基供体Z-FPA的结构。

表1. 不同聚半乳糖的阿拉伯糖修饰产物组成。

首先，作者根据已有报道的方法合成了一系列糖基数目从1~12不等的聚半乳糖。并通过液相色谱-质谱技术(LC-MS)证明了高表达AftA的耻垢分枝杆菌细胞膜与野生型耻垢分枝杆菌细胞膜均能够利用阿拉伯糖基供体分子Z-FPA对聚半乳糖进行阿拉伯糖修饰。随后作者进一步利用LC-MS分析了糖基化反应的产物(表1)，并发现在含3~12个聚半乳糖中，反应产物中存在阿拉伯糖修饰，且含3~6个聚半乳糖最多能够被两个阿拉伯糖基修饰，而含7~12个聚半乳糖则最多能被四个阿拉伯糖修饰，但多个阿拉伯糖的修饰方式尚未被分析。

接下来，作者对合成聚半乳糖上的阿拉伯糖修饰位点进行了鉴定(图2)。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)对含9个聚半乳糖与AftA的反应产物分析结果表明，阿拉伯糖的修饰位点仅存在于第六个半乳糖单体上。而后续作者也对含7或12个聚半乳糖的阿拉伯糖修饰产物进行了鉴定，发现阿拉伯糖的修饰同样也仅存在于第六个半乳糖单体上。

图2. 含9个聚半乳糖与AftA反应后产物质谱结果及分析。A.质荷比为1120.67，含两个阿拉伯糖修饰的聚糖二级质谱分析结果；B. 质荷比为1186.71，含三个阿拉伯糖修饰的聚糖二级质谱分析结果。

最后，作者对修饰过程中形成的糖苷键类型进行了表征(图3)。在通过一系列化学处理后，作者使用高效液相色谱(HPLC)、气相色谱-质谱(GC-MS)技术对含9个聚半乳糖的阿拉伯糖修饰产物及原料分别进行分析，并通过对比发现了修饰的阿拉伯糖基间会形成线性的1→5糖苷键，而阿拉伯糖与半乳糖间则通过β-(1→6)糖苷键相连，这与先前在分枝杆菌中鉴定得到的阿拉伯糖修饰糖苷键类型相同。

图3. 含9个聚半乳糖及其阿拉伯糖修饰产物中的糖苷键类型分析。A.阿拉伯糖修饰产物的HPLC分析结果；B.聚半乳糖原料的HPLC分析结果；C.化学处理后的不同种单糖及其对应质谱信息。

总而言之，本文中作者通过利用一系列体外合成的不同长度聚半乳糖，鉴定了体外AftA催化阿拉伯糖基转移至聚半乳糖的过程中具体的修饰位点及数目。结果表明，AftA能够催化聚半乳糖中的第六个半乳糖单体上发生阿拉伯糖基化反应，且能够修饰多个阿拉伯糖基，但与先前在其他原核生物的AG中观察到的阿拉伯糖基化位点及数目存在明显差异，有待于进一步通过在体实验进行验证。上述结果说明了部分AG在合成过程中可能仅会发生单一位点的阿拉伯糖基化修饰，且催化这一反应过程的AftA可能具有作为抗分枝杆菌的药物靶点的价值。