Mol Plant：魏鹏程团队利用Cas9变体扩展植物基因组编辑范围

来源：植物生物学

2020年12月27日，Molecular Plant 在线发表了安徽省农业科学院水稻研究所魏鹏程教授的题为Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical protospacer-adjacent motif compatibility in plants 的研究工作，通过利用Cas9变体扩展了植物基因组编辑范围，并将这些变体与大鼠APOBEC1或人APOBEC3A的胞嘧啶编辑器和直接进化的高亲和性TADA*-8E脱氨酶的腺嘌呤碱基编辑器相结合，开发出可用于水稻基因组定点碱基替换的工具。

对CRISPR-Cas系统来说， PAM (protospacer adjacent motif) 的捕获才能启动Cas复合体的靶向切割活性，因此Cas-PAM识别对区分自身基因组和入侵外源序列至关重要。但是对于CRISPR基因编辑工具，PAM限制了该工具的可识别范围。

其中，SpCas9系统因为它具有强大的效率， 是目前应用最广泛的序列特异性核酸酶系统。除了诱导靶向突变外，SpCas9系统还是开发多种植物基因组工程工具的默认平台，如精确编辑、基因表达调控、表观遗传修饰等。广泛使用的SpCas9需要靶点附近有NGG PAM才能发挥作用，影响基因组编辑能力。最近，5种SpCas9变体，包括SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH、SpCas9-NRTH、SpG和SpRY，被相继开发出来，并证明可以识别人类细胞中的非典型PAM结构。其中，SpCas9-NRRH、SpCas9-NRTH和SpCas9-NRCH可以识别人类细胞中的非G PAM（NRNH，其中R是A或G，H是A，C或T）。SpG和SpRY能将编辑范围扩展到不依赖PAM。

魏鹏程团队测试了不同的SpCas9变体在水稻中对各个典型和非典型的PAM位点的定向编辑效果，SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH和SpCas9-NRTH使水稻的基因编辑具有更广泛的PAM亲和性，其中，高达79.2%的品系在DL-TATA位点发生突变，31.3%的品系携带纯合子和双等位基因突变。这些结果表明这些突变体具有产生实际应用的靶向突变体的能力。在再生植株中评估了三个SpCas9变异体的潜在脱靶效应，没有发现脱靶突变。随后，检测了对目标基因的编辑活性，SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH和SpCas9-NRTH的突变频率大于5%，每个PAM的至少一个靶被有效地编辑。SpCas9-NRRH、SpCas9-NRCH和SpCas9-NRTH在8个、4个和6个位点的平均突变率均>50%，分别高达78.7%、83.2%和80.7%。结果表明，这三个变异体在植物中已建立的SpCas9系统的常规非靶向位点上显示出足够的活性。

紧接着，并将这些变体与大鼠APOBEC1或人APOBEC3A的胞嘧啶编辑器和直接进化的高亲和性TADA*-8E脱氨酶的腺嘌呤碱基编辑器相结合，开发出可用于水稻基因组定点碱基替换的工具，使得C-to-T的碱基替换能够实现除了NTG PAM之外，几乎没有PAM限制，而A-to-G的碱基替换拓展到NAB(B=C,T,G), NCR (R=A,G) 和NTK (K=T,G) 的PAM靶点。