北京市农林科学院玉米基因组编辑团队大幅拓展基因组编辑范围

来源：BioArt植物

12月27日，北京市农林科学院玉米基因组编辑团队在Molecular Plant上发表了题为Expanding Base Editing Scope to Near-PAMless with Engineered CRISPR-Cas9 Variants in Plant 的研究文章，成功开发了多个新型碱基编辑器，极大的拓展了植物基因组碱基编辑范围，尤其是C/T碱基编辑接近无任何PAM限制，PAM识别达到60种；A/G碱基编辑也达到了40种。

碱基编辑技术 (Base editing) 是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术，在2017年被Science杂志评为年度十大科学技术突破之一。碱基编辑范围受限于核酸酶识别的PAM序列，已发表文章中现有植物碱基编辑技术在总共64种PAM中仅能识别约20种。因此，亟需继续拓展碱基编辑的PAM范围。

该研究利用SpCas9的三个变体SpRY，SpNRRH和SpNRTH，开发出三款新的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE)，首次在植物中实现了除NTG PAM外几乎无任何其他PAM限制的C/T碱基替换。与此同时，该研究还利用SpRY开发出新的腺嘌呤碱基编辑器(ABE),将A/G碱基替换范围拓展到NAB (B=C,T,G), NCR (R=A,G) 和NTK (K=T,G) PAM靶点（见下图）。此外，对于NGC PAM靶点，SpRY碱基编辑器可以互补已有SpCas9-NG编辑器的不足。无论是SpRYn-CBE还是SpRYn-ABE对NGC PAM靶点的编辑效果都显著优于相应的SpCas9-NG碱基编辑器。最后，本研究对编辑器SpRYn-CBE和SpRYn-ABE的技术参数进行了详细分析，发现SpRYn-CBE的编辑窗口为靶点5端1-13bp，且第2，3，4，5位的C较其他位的C更易被编辑；SpRYn-ABE的编辑窗口为靶点5端2-14bp，且第4，5，6，7，8位的A较其他位的A更易被编辑。由于无论SpRYn-CBE还是SpRYn-ABE都能够识别esgRNA骨架上与靶点相连的GTT PAM序列，检测发现大约一半发生了碱基编辑的靶点产生了一定程度的T-DNA自切割；同时也由于二者都能够识别更多的PAM，脱靶效应都被检测到，但是脱靶位点比例总体上仍然较低。

除上述新型碱基编辑器外，该团队还在近两年开发出基于SpCas9及其变体VQR和xCas9、以及SaCas9变体SaKKH的多款新型碱基编辑器，实现了对PAM 为NAG、GA和松弛型的NG、NNMRRT及NNKRGT靶点的C至T碱基替换。综合应用这些具有不同特点的碱基编辑器，可以更大范围地拓展作物基因组上基因组编辑的可靶向区域，具有很大的应用潜力，同时可以为植物功能基因研究、快速精准育种提供技术支撑。