北京市农林科学院玉米基因组编辑团队大幅拓展基因组编辑范围

BioArt植物  |   2020-12-28 20:44

来源:BioArt植物

12月27日,北京市农林科学院玉米基因组编辑团队在Molecular Plant上发表了题为Expanding Base Editing Scope to Near-PAMless with Engineered CRISPR-Cas9 Variants in Plant 的研究文章,成功开发了多个新型碱基编辑器,极大的拓展了植物基因组碱基编辑范围,尤其是C/T碱基编辑接近无任何PAM限制,PAM识别达到60种;A/G碱基编辑也达到了40种。

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碱基编辑技术 (Base editing) 是基于CRISPR/Cas系统发展起来的新型靶基因修饰技术,在2017年被Science杂志评为年度十大科学技术突破之一。碱基编辑范围受限于核酸酶识别的PAM序列,已发表文章中现有植物碱基编辑技术在总共64种PAM中仅能识别约20种。因此,亟需继续拓展碱基编辑的PAM范围。

该研究利用SpCas9的三个变体SpRY,SpNRRH和SpNRTH,开发出三款新的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE),首次在植物中实现了除NTG PAM外几乎无任何其他PAM限制的C/T碱基替换。与此同时,该研究还利用SpRY开发出新的腺嘌呤碱基编辑器(ABE),将A/G碱基替换范围拓展到NAB (B=C,T,G), NCR (R=A,G) 和NTK (K=T,G) PAM靶点(见下图)。此外,对于NGC PAM靶点,SpRY碱基编辑器可以互补已有SpCas9-NG编辑器的不足。无论是SpRYn-CBE还是SpRYn-ABE对NGC PAM靶点的编辑效果都显著优于相应的SpCas9-NG碱基编辑器。最后,本研究对编辑器SpRYn-CBE和SpRYn-ABE的技术参数进行了详细分析,发现SpRYn-CBE的编辑窗口为靶点5端1-13bp,且第2,3,4,5位的C较其他位的C更易被编辑;SpRYn-ABE的编辑窗口为靶点5端2-14bp,且第4,5,6,7,8位的A较其他位的A更易被编辑。由于无论SpRYn-CBE还是SpRYn-ABE都能够识别esgRNA骨架上与靶点相连的GTT PAM序列,检测发现大约一半发生了碱基编辑的靶点产生了一定程度的T-DNA自切割;同时也由于二者都能够识别更多的PAM,脱靶效应都被检测到,但是脱靶位点比例总体上仍然较低。

除上述新型碱基编辑器外,该团队还在近两年开发出基于SpCas9及其变体VQR和xCas9、以及SaCas9变体SaKKH的多款新型碱基编辑器,实现了对PAM 为NAG、GA和松弛型的NG、NNMRRT及NNKRGT靶点的C至T碱基替换。综合应用这些具有不同特点的碱基编辑器,可以更大范围地拓展作物基因组上基因组编辑的可靶向区域,具有很大的应用潜力,同时可以为植物功能基因研究、快速精准育种提供技术支撑。

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张成伟、王瑶、王飞鹏为本文共同第一作者,杨进孝和赵久然研究员为本文共同通讯作者。本研究得到北京学者项目和北京市自然科学基金资助。

据悉,玉米基因组编辑团队于2017年组建成立,目前团队主要聚焦于碱基编辑、精确替换、组学编辑及其在玉米和水稻等作物中的高效应用。这是该团队自成立以来在国际学术期刊上发表的第9篇高水平研究论文。

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