SARS-CoV-2 D614G突变株高侵染性的结构基础

来源：病毒学界

截至2020年12月27日，全球新冠病毒累计感染人数已超过8000万，死亡人数达170多万。自新冠病毒在武汉爆发以来，已过去整整一年，在这一年里关于新冠病毒的基础研究迅速开展，相关诊断检测和治疗逐步完善，疫苗也已陆续上市并推广接种，然而我们对于新冠病毒的基本生物学问题认识还很有限，如病毒生命周期的细节，与宿主相互作用的分子机制等，特别是病毒变异对致病性和传播能力的影响是当前关注的焦点。病毒的变异是自然现象，在疫情初期就发现新冠病毒基因组存在不同突变位点，演化出L和S亚型，随着新冠病毒的全球大流行，疫情中期D614G突变毒株逐渐取代其他亚型，成为主导的毒株，与宿主细胞ACE2受体亲和力更强，而在最近英国等多国又相继发现B.1.1.7亚型，据估计传播性可能高出原始毒株70%。此前黄爱龙教授团队利用假病毒中和试验和细胞试验发现D614G突变能够促进蛋白酶切，增强病毒侵染能力，同时该突变可能改变了病毒免疫原性，使其对恢复期血清敏感性降低。另一项国外学者的研究则在叙利亚仓鼠模型中证实了D614G突变株复制和传播更加快速（见往期推送新冠病毒D614G突变株系复制能力和传播性更强）。孙强/黄红艳团队发现了D614G突变感染性增强新机制——双稳态调节，促进游离病毒粒结合、促进病毒结合细胞后解离（见往期推送孙强/黄红艳团队合作揭示D614G突变增强新冠病毒感染能力新机制）。然而目前对于D614G突变体的结构生物学研究还很少，近日，美国杜克大学的研究团队在Cell Reports上发表研究论文，研究者利用冷冻电镜三维重构技术，揭示了D614G突变体RBD结构域和抗原表位的改变，弗林蛋白酶切效率提高，对疫苗的研发提出了新的思考。

标题

目前大多数表达纯化的新冠病毒S蛋白结构都人为引入了两个突变，一个位于RRAR位点，破坏弗林蛋白酶切位点，另一个则位于双脯氨酸(PP)位点，用于阻止构象变为融合后状态，提高蛋白表达。这两个突变位点存在于刺突蛋白的胞外段，广泛应用于疫苗研制，作为多种疫苗的重要组分。研究者为了更好研究自然状态下病毒的特性，构建了含有原始序列的刺突蛋白基因载体，电镜复染发现与MERS、SARS和含有PP位点的SARS-CoV-2不同，野生型SARS-CoV-2同时具有融合前和融合后构象。冷冻电镜进一步解析了野生型刺突蛋白的结构，发现RBD区域具有开放和关闭两种构象，与原先测定的结构基本一致，但是在PP位点周围的盐键相互作用可能有一定差异。

野生型与PP位点突变刺突蛋白的差异

研究者进一步对D614G突变毒株进行了结构测定，发现刺突蛋白RBD的开放构象与典型的开放状态不同，同时也可以观察到S1亚基结构存在明显的异质性。与野生型相比，D614G刺突蛋白开放状态比例明显提高。由于D614G与RBD结构域相距较远，研究者推测这可能是通过别构效应调节刺突蛋白的构象。通过比较不同结构中RBD区域的变动，研究者发现RBD结构域和NTD结构域间的连接肽紧靠SD1和SD2区域，在RBD由关闭向开放转变的过程伴随着SD1区域的刚体运动，带有D614G的SD2区域则相对固定，充当RBD和NTD之间的锚点。因此D614G突变使得该区域更加固定，通过别构作用使得RBD结构域倾向于开放状态。

SD1和SD2区域结构

研究者注意到SD2区域具有弗林蛋白酶切位点，通过HRV3C替换弗林蛋白酶切位点构建未切割的刺突蛋白。体外酶切实验发现带有D614G突变的蛋白在含有或不含有弗林蛋白酶切位点情况下S1/S2区段对蛋白酶切都更为敏感。电镜三维结构观察发现，酶切后的D614G蛋白具有更高比例的关闭构象，对ACE2和中和抗体亲和力下降。