Cell：HT-recruit技术可平行检测成千上万个转录效应结构域的功能

来源：BioArt

基因的时空差异表达使得同一套基因组能够形成不同类型的组织细胞，转录因子在这个过程中起核心作用。转录因子特指能够序列特异性结合DNA并能调控RNA转录的蛋白质，它至少包含DNA-binding domain和effector domain两个功能结构域（下图）。不同转录因子结合DNA后产生的效应由effector domain募集的因子决定。一些转录因子（如TBP）能够直接募集RNA聚合酶，而其它大部分转录因子则通过征募cofactor（辅因子）来调控RNA转录，例如coactivator和corepressor【1,2】。人类蛋白质组含有超过1600个转录因子，虽然对其中一部分转录因子的DNA结合位点进行了一些高通量研究【3,4】，但是对绝大部分转录因子的效应功能并没有研究。 

LambertSA, et al. Cell, 2018 

研究转录因子效应功能的传统方法是征募实验：将待研究的转录因子或相关结构域与一个DNA结合结构域在细胞中融合表达，然后检测报告基因的表达活性【5】。但是由于要逐个克隆待研究的转录因子或效应结构域，然后将其转染进细胞并进行测量，所以实验通量很有限，这严重限制了我们对基因转录调控网络的整体认识。 

2020年12月15日，来自美国斯坦福大学的Lacramioara Bintu教授团队在Cell 上发表了题为High-ThroughputDiscovery and Characterization of Human Transcriptional Effectors的工作，开发了一种名叫HT-recruit（ahigh-throughput recruitment assay）的实验技术，能够平行检测成千上万个转录效应结构域的功能。 

HT-recruit技术有两个要点：首先，研究者改造了一个便于高通量筛选效应结构域的报告基因Igκ-hIgG1-Fc-PDGFRβ，其蛋白产物定位于细胞膜上，能够被proteinA/G的磁珠亲和分离纯化；其次，构建了一个人类转录因子效应结构域的慢病毒文库，将长度小于80个氨基酸的效应结构域与rTetRdox-inducible DNA-binding domain融合表达。这样，在细胞培养基中加入dox后，待研究的效应结构域将被rTetR募集到报告基因的启动子上。5天后，通过磁珠分离报告基因表达未被抑制的细胞，而未被磁珠分离的则是报告基因表达被抑制的细胞。然后通过高通量测序，检测各个效应结构域表达载体在磁珠分离与未分离细胞中的比例，从而评估各个效应结构域的转录调控功能（下图）。如果在5天后撤去培养基中的dox，并于第9天和第13天进行分离评估，还可以检测各个效应结构域对报告基因所造成的表观记忆。 

通过HT-recruit技术，研究者在文库中鉴定出了446个repressor和48个activator，发现：1.KRAB结构域并不都是转录抑制子，进化上年轻的KRAB结构域是转录抑制子，而进化年代久远的KRAB结构域是转录激活子；2.Homeodomain的转录抑制活性与Hox基因在染色体上的定位共线性，定位于5’端的Hox基因的Homeodomain的转录抑制活性强于定位于3’端的。此外，研究者展示了使用HT-recruit技术通过tiling文库发现细胞核蛋白上未被注释区域的效应结构域、以及使用HT-recruit技术通过深度突变扫描（DMS，DeepMutational Scan）发现ZNF10 KRAB结构域上关键氨基酸残基位点的应用实例（下图）。

这项技术为高通量注释转录因子的效应功能提供了一种实验方法，并且能够用于发现感兴趣蛋白质上的未被注释区域的潜在效应结构域，通过深度突变扫描还能寻找特定效应结构域上的关键氨基酸残基。但是限于目前的文库合成技术，这项工作仅对长度小于80个氨基酸的效应结构域进行了研究，并且有一部分效应结构域由于表达效果不好，并没有进行后续的功能鉴定。本项工作一共鉴定了600个人类转录因子上的3014个效应结构域的功能活性，但是这个数字离人类的1600个以上的转录因子还有一定距离。随着技术的进步，相信不久以后能够对转录因子的功能有更全面的认识，从而更深入的理解基因表达调控网络，开发出更好的方法来矫正疾病状态下基因表达的异常。

参考文献

1. Lambert, S. A. et al. The Human Transcription Factors. Cell 172, 650-665,doi:10.1016/j.cell.2018.01.029 (2018).

2. Reiter,F., Wienerroither, S. & Stark, A. Combinatorial function of transcriptionfactors and cofactors. Current opinion ingenetics & development 43,73-81, doi:10.1016/j.gde.2016.12.007 (2017).

3. Moore,J. E. et al. Expanded encyclopaediasof DNA elements in the human and mouse genomes. Nature 583, 699-710,doi:10.1038/s41586-020-2493-4 (2020).

4. Partridge,E. C. et al. Occupancy maps of 208chromatin-associated proteins in one human cell type. Nature 583, 720-728, doi:10.1038/s41586-020-2023-4(2020).

5. Tycko,J., Van, M. V., Elowitz, M. B. & Bintu, L. Advancing towards a globalmammalian gene regulation model through single-cell analysis and syntheticbiology. Current Opinion in Biomedical Engineering 4, 174-193, doi:https://doi.org/10.1016/j.cobme.2017.10.011 (2017).