PBJ：多重CRISPR快速高效突变特定植物组织多个基因

来源：植物科学最前沿

首先，对单个基因的操纵，由于基因冗余功能或多个同源基因的作用，可能无法产生具一定功能的理想的的表型。

虽然这一问题已经通过多路复用引导RNA(gRNA)得到了部分解决，但有人担心，随着靶点数量的增加，获得高阶敲除的机会会降低。

其次，敲除一些基本的很重要的基因可能会导致严重的多效性表型或致命性。

对体细胞组织中的基因进行组织特异性敲除可以克服这一限制，然而，在特定的组织环境中同时靶向三个以上基因的效率还没有被探索。

近日，Plant Biotechnology Journal在线发表了根特大学植物生物技术与生物信息学系Moritz K. Nowack等研究者的研究。

证明了无处不在的CRISPR和CRISPR-TSKO方法可以在第一代转基因中以高效的方式快速同时中断六个基因。

作者选择了6个有效的gRNA，来靶向6个基因(GFP，以及拟南芥基因SMB、EXI1、GL1、ARF7和ARF19)的编码序列，这些基因的敲除导致T1幼苗中容易观测的表型，比如GFP：GFP信号的丢失，SMB：根冠细胞的积累（如下图）。

作者构建了两个载体pPcUBI(I)和pPcUBI(II)，将由无处不在的pPcUBI启动子驱动的Cas9-mTagBFP2和六个gRNA以相反的顺序组合，并将它们转化为普遍表达核定位GFP的拟南芥品系。

96株pPcUBI(I)中有49株及95株pPcUBI(II)T1苗中有52株在根中同时表现出GFP和SMB表型，这表明同时发生了突变。

此外，79%的pPcUBI(I)和68%的pPcUBI(II)T1幼苗至少有一个可检测到的基因敲除表型也表现出三重GFP-SMB-GL1突变表型。

表明突变效率具有很强的相关性(如下图)。

作者后续又对实验组和对照组植株的Indel频率进行了量化，并用 Illumina技术进行了测序，等级聚类显示转基因T1植株分为两大类，它们对所有目标基因都有高水平或低水平的突变。

通过比较两种载体之间每个靶标的插入频率，以测试gRNA位置的影响，结果显示pPcUBI(II)的总体插入频率更高。

最后，作者通过在具有相同gRNAs排列的根冠特异性pSMB启动子下制作了两个表达Cas9-P2A-mTagBFP2的载体测试了六个基因是否可以在组织特异性的背景下有效突变。

选择很容易识别的活的根冠细胞中存在核的mTagBFP2信号进行共聚焦显微镜检测。

为了确定所有靶基因在表达Cas9的根冠细胞中的诱变效率，用荧光激活细胞分选法从10个pSMB(I)和8个pSMB(II)独立系的T2幼苗中收集了表达mTagBFP2(BFP+，Cas9表达细胞)的原生质体，直接从已分选的原生质体群体中扩增出目标位点，并进行NGS测序。

结果证实，在GFP和SMB诱变活性较高的品系中，所有基因都同时发生了高效突变。

本研究中，作者通过对普遍表达Cas9(pPcUBI)或根冠特异表达(pSMB)的拟南芥植株中的gRNA进行多路复用，我们证明了6个基因可以同时高效地突变，在第一代转基因(T1)中已经产生了更高顺序的突变表型。

所有目的基因的突变频率都是正相关的，不受载体中gRNAs顺序的影响，这表明在特定的植物组织中可以很容易地实现高效的高阶突变。

作者建议使用一个目标基因，该基因易于鉴定、且无害的功能丧失，作为高度诱变品系的替代，如报告品系中的绿色荧光蛋白缺失可以作为替代。

这种方法将成为剖析模式物种和农作物物种遗传网络的有力工具。