Cell：Tn7-CRISPR-Cas转座系统向导RNA的功能特化

来源：BioArt

作为原核生物的免疫系统，CRISPR-Cas系统在细菌和古细菌中广泛存在。此外，为更好的适应环境，原核生物还会“改造”CRISPR-Cas系统，以借助其中的向导RNA靶向特定位点。原核生物“改造”CRISPR-Caas系统的一个实例便是Tn7-like转座子中编码的CRISPR-Cas系统：这一Tn7-CRISPR-Cas转座系统可在向导RNA的引导下实现定向转座，并在2019年被研究者改造用于大片段DNA在细菌基因组中的定向整合（详见BioArt报道：专家点评Science+Nature长文| 当CRISPR遇上转座子——实现位点特异性DNA片段的高效、特异插入）【1,2】。不过研究者对Tn7-CRISPR-Cas转座系统的认识相当有限，转座子系统与传统CRISPR-Cas系统相互配合的机制依然有待研究，这也极大的限制了该系统的改造及在生物医学研究中的应用。

2020年12月02日，来自美国康奈尔大学微生物学系的Joseph E. Peters实验室在Cell发表题为Guide RNA Categorization Enables Target Site Choice in Tn7-CRISPR-Cas Transposons的论文。文章通过数据挖掘和相关实验对细菌中的I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统进行了汇总和分类。研究指出，I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统均可利用相应的向导RNA实现定向转座。此外Tn7-CRISPR-Cas系统演化出多种机制保障向导RNA功能的特化，以避免其对传统CRISPR-Cas系统的干扰而引发宿主毒性。

在对超5.3万种γ-变形菌的基因组进行数据挖掘后，研究者发现了802种I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统，并根据转座子插入位点的不同将其分为I-F3a和I-F3b两大类。在随后的CRISPR阵列（CRISPR arrays）分析中，研究者发现Tn7-CRISPR-Cas系统中所有的转座插入位点都有对应的向导RNA，这表明相关的转座事件都是在向导RNA的引导下实现。研究还发现，介导转座的向导RNA编码序列在CRISPR阵列中的位置都相对固定。此外，它们的重复序列（repeats）也迥异于阵列中其它向导RNA的重复序列，为此，研究者称其为非典型重复序列，而对应的向导RNA也被称为非典型向导RNA。而后的转座实验证实，与经典的向导RNA相比，这类非典型向导RNA介导转座的能力更强，而且转座能力的增强与非典型重复序列密切相关。

Tn7-CRISPR-Cas系统中的向导RNA与传统I-F型CRISPR-Cas系统的向导RNA并无明显区别，随之而来的问题便是：转座子的向导RNA是否会被传统的CRISPR-Cas系统所用，从而导致染色体降解和宿主毒性？研究者指出，转座子的向导RNA的确能被传统的CRISPR-Cas系统利用。不过，介导转座的向导RNA有独特之处：其间隔序列（spacer）中常可见很多碱基错配，无法完美匹配靶位点序列。虽然这种错配对转座影响甚微，但却会严重干扰传统CRISPR-Cas系统发挥功能。此外，非典型重复序列也会干扰传统CRISPR-Cas系统的功能，因此Tn7-CRISPR-Cas系统可通过向导RNA的错配以及非典型重复序列两种机制来避免其对传统CRISPR-Cas系统的干扰。 

不过在I-F3a系统中，介导转座的向导RNA难以通过非典型重复序列避免对传统CRISPR-Cas系统的干扰。研究者发现，Tn7-CRISPR-Cas系统还编码一种保守的Xre蛋白，它在I-F3a系统中可严格调控CRISPR阵列的转录和向导RNA的产生；而在I-F3b系统中，Xre则调控系统中关键蛋白的表达。Tn7-CRISPR-Cas系统进入新宿主时，Xre蛋白还未表达，向导RNA和关键蛋白会迅速高表达以介导转座的发生；随后Xre蛋白表达增加，在I-F3a系统中抑制向导RNA的产生，在I-F3b系统中则抑制关键的蛋白的产生，最终抑制Tn7-CRISPR-Cas系统的功能，避免其对传统CRISPR-Cas系统的干扰以降低对宿主的毒性。

图1 Tn7-CRISPR-Cas转座系统的示意图及向导RNA功能特化的机制

总体而言，本研究通过数据挖掘和生信分析，对I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统进行了系统的总结。此外，研究还对介导转座向导RNA的特点及功能特化进行了探索，发现I-F3型Tn7-CRISPR-Cas系统可通过向导RNA间隔序列的错配、非典型重复序列以及Xre蛋白的精细调控三种策略保证向导RNA功能的特异性，避免其对传统I型CRISPR-Cas系统产生干扰而引发宿主毒性。这一研究对Tn7-CRISPR-Cas转座系统向导RNA的改造和未来应用都有重要的指导意义。

参考文献

1. Klompe, S. E., Vo, P. L. H., Halpin-Healy, T. S. & Sternberg, S. H. Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNA integration. Nature 571, 219–225 (2019)

2. Strecker, J. et al. RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases. Science 365, 48–53 (2019)