CSRM2020丨ART中卵子与胚胎冷冻技术要点

来源：中华医学会生殖医学分会

中山大学附属第六医院  方丛

一、冷冻技术发展历程

冷冻技术是将胚胎和配子从生理温度降至低温并贮存的一项技术，需要时再从低温状态解冻至生理温度。1972年哺乳动物（小鼠）胚胎冷冻并解冻后移植获得成功，1983年，澳大利亚首先在人类胚胎冷冻方面取得突破，移植冻存胚胎后获得了妊娠。

1977年Whittingham将成熟鼠卵冷冻后保存在-196℃，解冻后发育成桑椹胚移植，出生小鼠。10年后Chen报道了成功冻存人类卵子。目前人类胚胎及卵子冷冻已得到广泛应用。

二、冷冻技术原理

低温对细胞内的生物化学反应过程将产生影响。温度降低也可对细胞产生直接影响，这种损伤主要与膜的通透性及细胞骨架的变化有关。水从液态变为固态的过程产生冰晶，大冰晶的形成是冻融过程中细胞损伤的主要因素之一，其他损伤还包括冷休克、溶质效应、重结晶、渗透性休克等。冷冻保护剂可以控制冷冻过程中产生的损伤，包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性保护剂。

三、人类胚胎和卵子的冷冻解冻技术要点

1.人卵玻璃化冷冻

（1）卵子冷冻皿的制备：在3002培养皿中，左上角做Hepes缓冲液滴1个，ES液滴2个（ES1、ES2），各约20 ul，尽量等大且成等边三角形排列，右上角用ES液做300微升大小的液滴1个（ES3）。在第二排用100微升大小的体积做三个VS液滴，室温下平衡30~60 min备用。

（2）卵子的平衡：将卵子用Hepes缓冲液冲洗去油，然后移入Hepes缓冲液滴停留1 min；将Hepes缓冲液滴与ES1液滴连线，计时3 min，其中2 min时将卵子移至液滴连线中间；在Hepes缓冲液滴与ES1连线的中点与ES2液滴再次连线，再计时3 min；再将卵子移入ES3液滴，停留6 min；

（3） VS中的操作：将平衡好的卵子迅速转移到VS的液滴中，计时90s，在VS中轻轻的反复吹吸，逐滴进行，直至最后一个VS液滴，然后装管，迅速插入液氮，插入后伴有在液氮中摇动，以加速降温，接着套上套管，放入相应位置的液氮罐中。

注意事项：从ES至VS，携带尽量少的ES液装载体时，载体上要适当减少VS量，用吸管吸去多余的液体。

2.胚胎玻璃化冷冻方法及要点 

（1）冷冻皿采用四孔皿，以四孔皿带有斜边的角为左上角即定义为A，然后顺时针方向依次定义为B孔、C孔、D孔，A孔加1 ml Hepes缓冲洗液，B孔加1 ml ES液，C孔加1 ml VS液，预热至室温备用。

（2）与培养室人员核对患者姓名和冷冻胚胎后，将需要冷冻的胚胎用巴斯德吸管从培养皿转移到预先备好的冷冻皿的A液中，轻轻的吹洗几次，去除胚胎表面及吸管头部的矿物油； 

（3）平衡：将吹洗干净的胚胎转移B液的顶部，让其自由慢慢下沉不用吹吸，计时10~12 min；

（4）将平衡好的胚胎迅速转移到右下角的第1个C液中，计时1 min（包括第二个C液中的时间），在C液中不同位置轻轻的冲洗，然后转移至第二个C液中，避免沾有矿物油，然后装载体(装载体时与培养室人员双人核对标签上和患者姓名和管号)，迅速插入液氮，插入后在液氮中摇动，接着套上套管，放入支架或支管； 

四、人类胚胎和卵子的解冻要点

（1）建议TS液体量要大，复温速度足够快是关键。 

（2）将装液氮的容器和胚胎载体尽量靠近显微镜，以取得进入TS液之间最短距离。 

（3）将载体从液氮中取出后，以最快速度放入TS中，并在显微镜下确定卵子/胚胎已从载体上落到 TS 中，（可轻晃使其落下），然后再将载体移开。 

（4）转移到DS时，可带有少量TS（玻璃管端约2 mm的TS液体）,把卵子/胚胎放入底部，液体会慢慢扩散。使卵子/胚胎慢慢适应DS。