JACS:小分子荧光探针用于活细胞中鞘氨醇的检测

CBG资讯  |   2020-11-27 10:30

来源:CBG资讯

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鞘氨醇(Sph)和二氢(神经)鞘氨醇(Spa)是一种单链鞘脂,它们不仅充当复杂鞘脂的骨架,还具有生物信号传导功能,在细胞功能和疾病(例如癌症和尼曼-匹克氏病C型)中扮演着重要角色。不幸的是,由于缺乏在活细胞中对鞘氨醇进行成像和检测的技术,探究鞘氨醇在生物学和疾病中的功能和行为具有一定的困难。近年来,荧光标记的脂质已间接用于研究鞘脂在细胞中的定位,但无法提供有关内源性脂质浓度的信息。因此,开发在活细胞中检测和成像鞘氨醇的方法显得尤为重要。

基于此,美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校Neal K. Devaraj教授课题组开发了一种小分子荧光开启探针,用于标记活细胞中的鞘氨醇。该探针表现出对鞘氨醇的剂量依赖性反应,并且能够检测内源性鞘氨醇。另外,作者基于该探针成功地证明了尼曼-匹克氏病C1型(NPC1)患者中鞘氨醇在细胞中的蓄积。相关成果以“A Small Molecule Fluorogenic Probe for the Detection of Sphingosinein Living Cells”为题发表在J. Am. Chem. Soc.上(DOI: 10.1021/jacs.0c06652)。

首先,基于脂肪酸水杨醛酯和1,2-氨基醇(Sph和Spa中存在)可以在生物条件下选择性反应,作者假设水杨醛的荧光团酯可以用于构建检测内源性Sph和Spa的探针,且利用荧光淬灭基团使探针不产生荧光。探针与Sph或Spa反应后,荧光团将从水杨醛转移至鞘脂碱基,同时其与淬灭剂的亲和性降低而产生荧光(Figure 1A)。

作者选择Bodipy FL作为荧光团,选择Black Hole Quencher-1(BHQ-1)作为淬灭剂进行探针设计。探针1的反应性核心为4-二烷基胺官能团类似物(Figure 1B)。此外,作者合成了一个与1相同的对照探针2,只是它缺少与末端1,2-氨基醇基团选择性反应所必需的醛,因此不会与细胞中的鞘脂碱基反应。

接下来,作者在鞘脂碱基和潜在竞争生物分子存在的情况下,定量研究了1的荧光开启。当1(5 μM)与Sph(0.25 mM)或Spa(0.25 mM)在37 ℃下孵育24 h时,作者观察到3倍和2.5倍的荧光开启。但是,当在相同条件下将1与丝氨酸(2.50 mM)或鞘氨醇1-磷酸(Sph1P)(0.25 mM)孵育时,荧光强度没有变化(Figure 1C),表明探针1具有良好的选择性。

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随后,为了确定1是否可以与活细胞中的Sph反应,作者将1(7.5 μM)与HeLa细胞孵育2 h,然后将细胞培养基换为含有不同浓度Sph的新培养基。结果发现,在孵育20 h后,经外源Sph处理的细胞显示出剂量依赖性的荧光增强(Figure 2A, B)。另外,作者用2进行了相同的实验,发现未处理的对照组与用Sph处理的细胞之间的荧光并没有显著的差异(Figure 2A, C)。

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最后,作者将探针应用于细胞内鞘氨醇水平的检测。作者用1或2(20 μM)处理HeLa细胞,并进行孵育前和孵育16 h后的成像研究,发现经1处理的细胞中很容易检测到荧光增强信号(17.4%)(Figure 3A),而经2处理的细胞仅显示出细微的荧光增强信号(4.7%)(Figure 3A, B)。以上结果表明1用来检测天然鞘氨醇的时候具有高敏感性,可用于探究细胞中鞘氨醇水平的差异。

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NPC1是一种由NPC1基因突变引起的溶酶体贮积病,在NPC1突变时,它会导致几种脂质(包括鞘氨醇)的积累。为了研究1是否可以用于检测NPC1患者中鞘氨醇的积累,作者培养了来自健康人群以及NPC1患者的成纤维细胞。用1(7.5 μM)孵育细胞24 h后,作者观察到NPC1细胞显示出更强的荧光信号(Figure 4)。

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总而言之,作者设计并合成了一种用于活细胞中Sph检测的荧光探针。该探针可结合荧光显微成像技术对哺乳动物细胞中的Sph进行浓度检测,并有望成为NPC1和戈谢病(Gaucher disease)等脂质沉积障碍疾病的诊断工具,推动了生物学研究。

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