转基因动物

科技工作者之家  |   2020-11-17 17:36

遗传的基本物质是DNA,基因则是位于染色体上有遗传效应的DNA片段,对于储存在生物全套染色体中的全部遗传信息,可称其为基因组。由于不同种类、不同个体的生物基因组成是不同的,因此对动物个体来说,非自身的基因成分属于外源基因,如果把外源基因整合或导入动物染色体基因中,那么这个外源基因就被称为转基因(transgene)(即转移来的基因),这种动物就是转基因动物(transgenic animals)。

转基因动物表达系统,包括外源基因、表达载体和受体细胞等,基因组的转移则是细胞核移植和动物克隆技术,人工合成与设计基因、全基因乃至基因组的转基因技术是合成生物学。

转移方法哺乳类动物基因转移方法,是将改建后的目的基因(或基因组片段)用显微注射等方法注入实验动物的受精卵(或着床前的胚胎细胞),然后将此受精卵(或着床前的胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管(或子宫)中,使其发育成携带有外源基因的转基因动物。1

根据外源基因导入的方法和对象的不同,目前制作转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)法、电脉冲法、精子载体导入法等。

显微注射是最常用且成功率较高的方法,以转基因小鼠的制作为例,大致过程如下。

一、采集受精卵

(1)超数排卵:选取6~8周龄的雌性小鼠,先后腹腔注射5U孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonactotropin,PMSG)和2.5~5.0U人绒毛膜促性腺激素(humar chorionic gonactotropin,HCG),以促进排卵,然后与鼠龄为12周~l年的雄性小鼠按1:1交配。交配成功的标志是在雌性小鼠的阴道口发现白色的阴道栓。2

(2)取受精卵:与雄性小鼠合笼的次日上午,将确认有阴道栓的雌性小鼠用颈椎脱臼法剖杀,取出输卵管,置于培养液中,在体视显微镜下小心的切开输卵管膨大的壶腹部,用透明质酸酶溶液稍用力冲洗,使受精卵与输卵管分离,并流到培养液中,在体视显微镜下选择原核清晰的受精卵,移人装有培养液的胚胎培养皿中,然后在培养皿滴加矿物油使之覆盖在培养液表面,在CO2孵箱(37℃,5%CO2,95%空气)中培养5h左右(一般在上午10时左右取受精卵,培养至l3时可见雌、雄性原核,多数受精卵通常在13~18时之间原核形成并清晰可见)。

二、向受精卵雄性原核注入DNA溶液

受精卵中,有分别来自卵子和精子的两个原核,通常来自精子的雄性原核较大,能容纳更多的外源DNA,因此一般都是向雄性原核注入DNA溶液;另外,要导入的基因DNA还必须先用琼脂糖凝胶电泳法测定其纯度。将含有10~20个受精卵的培养液滴和DNA液滴共同滴放于载玻片上,然后固定在显微注射仪的载物台上,将视野中央调于DNA液滴上,右手持充满矿物油的玻璃吸管吸取DNA溶液,吸入量以DNA溶液和矿物油之间出现弯月形位置为准,然后再将视野中央移至受精卵液滴上,左手控制持卵吸管,利用负压将受精卵固定,并将右手的吸管尖端移至固定了的受精卵上,继而插入受精卵雄性原核,将DNA溶液注人雄性原核中,为肯定是否已注入,须用肉眼确定雄性原核是否膨大。仅将未损坏的完成操作的卵收集起来,在37℃的CO2孵箱中培养过夜,第2天将发育成2细胞的卵挑选出来。

三、将2细胞的受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的输卵管中

用结扎了输精管的雄性小鼠与发情期的雌性小鼠(一般选用ICR小鼠)进行交配,虽然不能引起受精,但可以刺激子宫颈管,使雌性小鼠体内的黄体活化,造成能继续妊娠的内分泌环境,这种小鼠称为假孕雌性小鼠。将经显微注射的细胞受精卵移植至交配第3天的假孕母鼠输卵管中,仍可正常发育。操作时,最好是在两侧输卵管同时移植。这样,情况良好时可得8只仔鼠,有时仅能产生1只仔鼠,因为DNA注入而造成的损伤可使许多受精卵在中途停止发育。

四、导入基因的鉴定

通常,胚胎移植生育出的全部仔鼠中,约有20%~30%具有导入基因,因此要用Southern Blot或PCR法对导入的遗传基因进行分析,以便挑选制作外源性基因导入成功的小鼠进行饲养和繁殖。

基因显微注射法的特点是外源基因的导入整合效率较高,不需载体,直接转移目的基因,目的基因的长度可达lOOkb(10万个碱基对)。它可直接获得纯系,所以实验周期短。但需要贵重精密仪器,技术操作难度大,并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制,易造成宿主动物基因组的插入突变,引起相应的性状改变,重则致死。

反转录病毒****感染法

反转录病毒具有侵入宿主细胞并整合于细胞染色体DNA的能力。将外源基因DNA插入反转录病毒载体,通过辅助细胞包装成高感染度的病毒颗粒,感染胚胎后,将感染的桑椹期胚胎细胞导入子宫,可发育成携带外源基因的子代动物。

该法整合率较高,目的基因不易破坏,多是单拷贝、单位点整合,适合于难以观察到原核的禽类受精卵。由于病毒衣壳大小的限制,目的基因不宜超过10kb,否则影响活性和稳定。此外,病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达。

胚胎干细胞法胚胎干细胞(ES细胞)是指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞,具有发育全能性,能进行体外培养

  • 周泉水
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    农业生产的发展和进步,安全食品的充分供给,永远是人类生存的保障。因此,合理的发展和应用转基因技术,不断创新,在优化品种的同时,减少这项技术对化学农业的促进,使之更好的造福人类、兴盛产业,是我们必然的努力方向。
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