细菌染色技术是为了便于观察研究而利用有关染料使细菌细胞着色的方法。细菌个体微小，无色透明，因此常采用染色法来观察其大小和形态结构。染色的基本步骤为涂片→干燥→固定→染色。常用方法有五种。1
简介细菌染色法是为了便于观察研究而利用有关染料使细菌细胞着色的方法。细菌个体微小，无色透明，因此常采用染色法来观察其大小和形态结构。染色的基本步骤为涂片→干燥→固定→染色。常见的染色方法包括简单染色、负染色、革兰氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、荚膜染色、死活染色。制备细菌染色片一般要经过涂片、固定、染色、水洗、干燥等步骤，然后用显微镜甚至油镜观察。
常用方法有①革兰氏染色法，是一种复染色方法，即选用结晶紫和石碳酸复红两种染液染色的方法，依此将细菌分成革兰氏阳性菌(记G+)和革兰氏阴性菌(记G-)。②简单染色法，是用一种染液染色的方法，如美兰或石碳酸复红等，此法只能显示细菌的形态及大小。③特殊结构染色法，是染色细菌细胞特殊结构，如鞭毛、荚膜、芽孢、异染颗粒等需用的方法 。④负染色法，是指背景着色而细菌本身不着色，常用染料有墨汁、水溶性苯胺黑等，用于检查细菌的荚膜。⑤荧光染色法，即用荧光染料，如金胺、吖啶类染料进行染色，用于细菌不同部位的形态观察。1
主要类型革兰氏染色法革兰氏染色法是最常用的鉴别染色法之一。此法起始1881年，染色步骤是先用结晶紫或龙胆紫染液加于已固定好的标本上使之着色，其后加碘液作媒染剂，再用酒精脱色，最后用复红或沙黄复染。革兰氏染色的结果与培养基成分、培养条件及操作技术等有密切关系。如涂片太厚影响酒精脱色，革兰氏阴性菌则可染成革兰氏阳性菌。脱色时若酒精作用时间太长，革兰氏阳性菌又会染成革兰氏阴性菌。在缺乏镁盐的培养基中，革兰氏阳性菌可变成革兰氏阴性菌。菌龄也能影响染色的结果，这与生长过程中核酸含量的改变有关。革兰氏染色法的原理还不十分清楚，有化学学说、等电点学说、渗透性学法，目前最通常的解释是革兰氏阳性菌在95%酒精中因含粘肽多而导致细胞壁脱水，通透性减低，使在细菌细胞内着色的染料─碘复合物不易透出细胞壁，所以保留了紫色；革兰氏阴性菌含粘肽少，其细胞壁在95%酒精作用下通透性变化不大，酒精容易进入菌体内溶解染料─碘复合物而透出，失去紫色后被复染成为红色。
抗酸染色法有些细菌，如结核杆菌，不般不易着色，一旦染上色后又不易被盐酸酒精脱色，称为抗酸菌。主要步骤是将细菌涂片、干燥、固定后，以石炭酸复红染液加温进行染色，然后用含酸的酒精脱色，最后用美蓝复染。一般细菌以及标本中的物质都被脱色，抗酸菌则不能，仍为红色。在蓝色背景上呈红色的细菌即为抗酸菌。
细菌特殊结构的染色法细菌的特殊结构，如鞭毛、荚膜、细胞壁、芽孢及异染颗粒等，用普通染色法不易着色，故需用特殊染色法。
1、芽孢染色法：部分细菌能产生内孢子，这些孢子能抵制细菌染色液的进入，在革兰氏染色法涂片染色时，革兰氏阳性菌的芽孢呈现无色。虽然芽孢在革兰氏染色片中可以看到，但在不易清晰观察时，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢与菌体呈现不同颜色，便于观察。主要的芽孢染色法有孔雀绿染色法和石碳酸复红染色法。
孔雀绿染色法的具体步骤：首先将生有芽孢的斜面菌苔按革兰氏染色法涂片后，用饱和孔雀绿水溶液染色10min，然后用自来水冲洗，冲洗完后用0.5%蕃红液复染30s，用水洗，吸干，即可镜检，镜检时芽孢呈绿色，菌体和芽孢囊呈微红色。
石碳酸蕃红染色法具体步骤：首先按常规涂片，然后滴加石碳酸复红于涂片上，并于玻片下缓缓加热，使染液冒蒸汽但不沸腾，并继续滴加染液，不使涂片上染液蒸干，这样保持5min。带涂片冷却后，倾去染液，用酸性乙醇脱色指无红色染剂洗脱为止，接着彻底水洗，洗后用吕氏美蓝复染2-3min，水洗吸干后即可进行镜检，镜检时菌体计孢囊呈蓝色，芽孢呈红色。
2、鞭毛染色法：鞭毛是细菌的运动器官，非常纤细，超出了光学显微镜观察极限，因此通常情况下在显微镜下观察不到。通过特殊的染色技术，可以将染色液附加到鞭毛的周围，增加它的直径，从而能在光学显微镜下观察到鞭毛。鞭毛染色一般分银盐法和复红沉淀法两种。这里介绍一下银盐沉淀法。用作鞭毛染色的载玻片必须是绝对干净无油脂的，将载玻片在火焰上快速灼烧5s，放在染色架上冷却，用蜡笔分成两个区域，然后用移液管或者巴斯德移液管吸取2mL无菌水加入到幼龄生长活跃的斜面菌株中，慢慢震荡并旋转试管使菌株悬浮，尽量避免使用接种环，将悬液转移到干净的试管中，通过悬滴试验检查菌体的运动型，用无菌水将悬浮液稀释至略有浑浊为止，放入20-30℃培养箱中培养30min，然后移取一满环悬浮液加在已冷却的载玻片一端，倾斜载玻片让液滴流到蜡笔画的中心线，在空气中自然干燥。然后用媒染色剂媒染5min之后，慢慢用蒸馏水充分漂洗掉所有的媒染液，用热的Fontana银盐覆盖，染色5min，每隔1min更换一次染色液（Fontana银液在沸水浴中加热），细菌涂层的每一部分都要浸在染色液中，不能裸露。最有用水冲洗，自然晾干即可进行镜检。应当注意一点，染色法的燃料须当日配制，4h内使用，最好是现配现用
3、荚膜染色：一般细菌的荚膜与染色剂的亲和性低，但荚膜通透性高，因此染料可以透过荚膜使菌体着色。一般采用负染色方法使背景和菌体之间形成一透明区，将菌体衬托出来便于观察分辨。荚膜染色的步骤：加一滴6%葡萄糖水溶液在载玻片的一端，无菌操作，挑取细菌斜面上培养72h左右的胶质芽孢杆菌与其混合，加1滴墨汁充分混匀，用推片法制片将菌液铺成薄层，自然干燥，滴加1-2滴无水乙醇覆盖涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%结晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸铜冲洗数次，再用自来水冲洗一次，使用擦镜纸擦干后即可镜检。有荚膜的菌菌体呈紫色，背景灰黑色，荚膜不着色呈无色透明圈。
负染色法负染色法是指背景着色而细菌本身不着色。常用墨汁负染色法配合单染色法（如美蓝）检查细菌的荚膜，背景呈黑色，菌体染成蓝色，荚膜不着色，包绕在菌体周围，成为一层透明的空圈。
负染色法常见有两种操作方法。第一种发个方法比较常见，在一个载玻片上将微生物与异地苯胺黑混合，用另外的载玻片将混合物均匀的覆盖于原来的载玻片上。该方法的目的是使混合物在在玻片上一边厚一边薄，在厚与薄中间的额区域就是最佳观察区域。第二种方法是用一接种环苯胺黑与微生物混合，用接种针在载玻片的中央将混合物延伸很小的区域。
荧光染色法用荧光染料，如金胺、吖啶橙等进行染色。细菌用荧光染料着色后在荧光显微镜下检查，可在黑的背景中观察到细菌发出明亮的荧光。用荧光染色法检查细菌，有加快检查速度和提高阳性率等优点。1
本词条内容贡献者为:
吴俊文 - 博士 - 厦门大学