单基因三靶点编辑效率达到100%，双基因六靶点编辑效率达到96%

来源：植物科学最前沿

小麦多基因多靶点编辑技术方面取得重大进展，单基因三靶点同时编辑效率达到100%，双基因六靶点同时编辑效率达到96%，三基因八靶点同时编辑效率达到37%。

小麦是重要的粮食作物，突破性的小麦品种对保障粮食安全至关重要。基因组编辑技术是创制突破性种质资源、加速育种进程的有效手段。但小麦是异源六倍体，基因组复杂，要实现多个基因A、B、D三个基因组上的多靶点同时编辑非常困难。虽然小麦多基因编辑已有报道，但与水稻、玉米等作物相比，仍然存在编辑效率低、突变体纯合慢等问题。针对上述问题，山东省农业科学院作物研究所小麦分子育种团队，通过载体元件的优化改造，研发了高效的小麦多基因多靶点编辑技术体系，使小麦的单基因三靶点同时编辑效率达到100%，双基因六靶点同时编辑效率达到96%，三基因八靶点同时编辑效率达到37%。相关研究成果以“Efficient multiplex genome editing by CRISPR/Cas9 in common wheat”为题，于2020年11月5日在线发表在Plant Biotechnology Journal上。

该研究对小麦基因编辑载体元件进行了系统优化，构建了3个小麦多基因编辑载体系统，分别为基于Pol III 型启动子的TRSP、tRNA和基于Pol II型启动子的核酶系统（图1a）。设计的3个gRNA分别靶向TaDA1、TaPDS和TaNCED1在A、B和D基因组上的8个位点（图1b）。利用该课题组高效的农杆菌介导的小麦转基因技术和平台，分别获得了22、26和 27个T0代转基因阳性株系。利用PCR扩增靶位点附近序列，结合NGS测序方式分析了基因编辑类型，发现tRNA和核酶系统的编辑效率显著高于TRSP系统（图1c），其中，核酶系统对TaPDS基因的编辑效率在A、B、D三个基因组上均达到100%，并且有22个株系出现白化表型，白化苗数为TRSP、tRNA系统的4.4倍（TRSP、tRNA系统均只有5个白化苗）。进一步分析发现，上述三个编辑系统均可实现三基因八靶点的同时编辑（图1e），其中tRNA和核酶系统同时编辑的效率分别为34.62%和37.04%，而TRSP系统仅为18.18%（图1f）。

图1 CRISPR/Cas9介导的小麦多基因编辑系统

为进一步探究基因型和表型的关系，作者对单个株系中野生型和突变型基因的比例进行分析，发现核酶系统同时显著提高了TaDA1和TaPDS突变型的比例（图1g），即核酶系统显著降低了单个株系中基因野生型的比例。为量化基因型和表型的关系，作者以TaPDS为例，对绿苗（无表型）、嵌合体和白化苗（图1h）中突变基因型的比例进行统计，发现只有单个株系中A、B和D基因组上突变型比例平均值高于80.59%才会出现白化表型，低于69.10%为绿色（图1i）。上述数据说明，核酶系统不仅编辑效率最高，而且它还显著提高单个株系中A、B、D三个基因组上同源基因同时突变的几率，使T0代获得突变表型的几率大大增加，该研究结果对何时进行小麦突变体表型鉴定具有指导意义。

山东农业科学院作物研究所李根英研究员和李玉莲副研究员为论文的共同通讯作者，助理研究员李吉虎和副研究员张淑娟为该文共同第一作者，美国马里兰大学的戚益平副教授作为作者之一，参入了本研究。该研究获得了山东省农业良种工程、国家重点研发计划、国家自然科学基金、山东省农业科学院农业科技创新工程和美国马里兰大学启动基金的资助。