华南农业大学刘耀光院士团队开发植物高效、广靶向胞嘧啶单碱基编辑器PhieCBEs

来源：植物科学最前沿

2020 年11月3日，华南农业大学生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室刘耀光院士研究团队在 Molecular Plant 在线发表了题为 “PhieCBEs: Plant High-efficiency Cytidine Base Editors with Expanded Target Range”的研究论文，该研究开发了一套高效、广靶向的植物胞嘧啶单碱基编辑器PhieCBEs (plant high-efficiency CBEs)。

胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）是基于CRISPR/Cas系统开发的不造成双链DNA断裂、不需要供体模板的碱基替换方法，能分别实现C-T（G-A）或A-G（T-C）的碱基精准替换，为动植物的遗传修饰提供了一种有效策略。但CBEs系统的早期版本（如BE1、BE2、BE3和BE4）在植物细胞中的编辑效率较低（平均大约0～30%），且来自大鼠rAPOBEC1胞嘧啶脱氨酶本身对靶点序列具有偏好性，易于编辑TC、CC位点（下划线为被编辑碱基），而几乎不编辑GC，因此编辑效果极不稳定。

使用来自七鳃鳗的PmCDA1脱氨酶和来自人的APOBEC3A脱氨酶（hA3A）、以及使用代理报告系统DisSUGs的CBE在一定程度上提高了植物基因组的编辑效率。此外，目前大多数CBE系统是基于融合识别NGG-PAM的Cas9n，它降低了基因组靶点的选择性。这些因素限制了CBE在植物系统中的广泛应用。因此，开发更加高效、操作简便的植物CBE系统，对促进基因功能研究、加快农作物遗传改良进程具有重要作用与现实意义。

此前，哈佛大学David R. Liu研究团队利用噬菌体辅助连续进化系统（PACE）获得了多个进化型的胞嘧啶脱氨酶，其中evorAPOBEC1，evoFERNY （来自APOBEC的祖先节点656，Anc656）和evoCDA1具有较高的效率，并利用它们开发了适用于哺乳动物细胞的无靶序列的偏好性的高效CBE系统 （evoBE4max）。然而，仍然不清楚基于这些进化型脱氨酶，特别是与Cas9n-NG（识别更广泛靶点选择的NG-PAM）的融合，是否在植物系统中也可以高效地发挥作用。

刘耀光院士团队根据水稻密码子偏好性重新优化evorAPOCBEC1、evoFERNY、evoCDA1和hA3A的核酸序列，并将它们与Cas9n-NG变体融合（其中evoCDA1还与一种新的eCas9n-NG变体融合），以及利用高效核定位信号bpNLS，开发了一套植物胞嘧啶单碱基编辑器PhieCBEs（PevorAC1-NG、PevoFERNY-NG、PevoCDA1-NG、PhA3A-max-NG和PevoCDA1-eNG），并分别测试了水稻的9个靶点（含有NG-PAM或NGG-PAM）的编辑效率等特性。结果显示，PhieCBEs和一种BE4对照rAC1-NG相比，其平均编辑效率提高了3~8倍 ，消除了碱基序列环境的偏好性，且展现不同的编辑窗口和较低的T-DNA自靶向编辑效率。其中， PevoFERNY-NG表现最突出，在NG-PAM和NGG-PAM靶点都有较高的编辑效率（40.6~82.7%，平均62.6%），主要编辑窗口为C3~C8，以及产生较少的非C-T的副产物（2.9%）和较低的T-DNA自靶向突变效率（6.9%）。

PhieCBEs载体的结构（A）和编辑效率（B）

这套高效、广靶向的植物PhieCBEs编辑系统的建立，为水稻和其他植物（作物）的单碱基编辑提供了更为有效的工具，有望在基因功能筛选、大规模饱和突变、编辑调控元件、引入提前终止密码子或进行可变剪接等研究中有广泛应用。

华南农业大学博士后曾栋昌和研究生刘涛利为论文的共同第一作者，刘耀光院士和祝钦泷教授为论文的通讯作者。该研究获得广东省基础与应用基础研究重大项目、国家自然科学基金项目和广东特支计划科技创新青年拔尖人才专项的资助。