单细胞cAMP信号通路调控的光遗传学工具

来源：ACS美国化学会

“Single-Cell Activation of the cAMP-Signaling Pathway in 3D Tissues with FRET-Assisted Two-Photon Activation of bPAC”。文章的通讯作者是来自京都大学的Kenta Terai教授，他的课题组致力于发展可用于探究细胞中信号转导的成像工具。在这篇文章中，他们基于可被光激活的细菌腺苷环化酶(Bacterial photoactivated adenylyl cyclase，bPAC)，发展了一种能够被双光子激发的光遗传学工具2pabPAC。2pabPAC可在单细胞层面上诱导细胞内第二信使分子cAMP水平上升并激活cAMP依赖的信号通路，这一工具也可用于小鼠肝脏组织中单个细胞的信号通路研究。

环状腺苷酸(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是一种在细胞中广泛存在并参与多种生理过程的第二信使分子。在cAMP的下游效应因子中，涉及到蛋白激酶A(Protein Kinase A，PKA)的研究最为广泛，PKA能够调控包括葡萄糖代谢、激素分泌以及记忆形成在内的一系列功能。通过一系列小分子化合物，人们可在细胞内实现cAMP水平的调节，以此控制cAMP/PKA通路。然而这一手段难以实现高时空分辨率下对细胞的调控，且无法精确地表征细胞信号转导网络。基于黄素蛋白(Flavoproteins)的光遗传学技术在一定程度上可克服以上缺点。因此，发展能够在单个细胞水平上精准调控cAMP水平的工具，对于细胞内信号转导通路的研究具有重要意义。

图1. A)可被双光子激发并产生cAMP的光遗传学工具2pabPAC原理示意图；B-C)通过FLIM表征2pabPAC及其突变体的荧光寿命。

bPAC是一种来自贝氏硫菌属的光激活腺苷环化酶，它通过连接一种依赖于黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)的蓝光传感器，能够在细胞中快速产生cAMP。在这篇文章中，作者将bPAC与荧光蛋白mTFP1融合，得到了一种新的融合蛋白2pabPAC。mTFP1吸收双光子之后产生荧光共振能量转移(FRET)现象，发射出一定波长的光子激发bPAC的辅基FAD，从而在细胞中产生cAMP(见图1-A)。作者构建了一系列含有mTFP1与bPAC的融合蛋白并比较了它们的荧光寿命。作者从中选择了荧光寿命降低最为明显的mTFP1ΔC11-bPAC，将其命名为2pabPAC，用于后续的实验(见图1-C)。

图2. A)2pabPAC在细胞中产生cAMP并激活PKA传感器Booster-PKA；B)双光子与单光子激发2pabPAC与突变体2pabPAC(Y72L)并检测PKA活性；C)PKA活性与2pabPAC表达量的相关性。

通过荧光寿命的减少时间，可以计算出2pabPAC的FRET效率约为43%，为了证明它确实在双光子激发条件下能够产生cAMP，作者应用了一种能够用于研究细胞内PKA活性的生物传感器Booster-PKA(见图2-A)。另外，作者将2pabPAC上mTFP1的72位酪氨酸突变位亮氨酸，构建了无荧光活性的2pabPAC(Y72L)作为负对照。用双光子激发表达2pabPAC的细胞能够检测到PKA活性，且活性程度与用单光子激发时的水平基本一致；然而表达了突变体2pabPAC(Y72L)的细胞则只能被单光子激发(见图2-B)。需要注意的是，2pabPAC的过表达会导致在未激发状态下细胞内PKA的本底活性上升(见图2-C)，因此后续作者选择了表达水平适中的细胞作为实验对象。

图3. A)在犬肾细胞3D组织中用分别双光子与单光子激发2pabPAC；B)在激发了2pabPAC的靶细胞中检测PKA信号随着时间的变化趋势；C)在表达与未表达2pabPAC的细胞中检测激发后的PKA活性；D)在3D组织中检测激发2pabPAC对于ERK通路的影响。 

双光子显微镜的一个独特优势是可以用于3D空间中在单细胞层面上激发荧光基团，因此作者在进一步探究了2pabPAC这一工具的可重复性与可逆性之后，随后将2pabPAC应用在了体外培养的细胞组织中。作者构建了稳定表达Booster-PKA以及2pabPAC的犬肾细胞(MDCK Cells)，并将细胞培养为3D模型组织。在双光子激发单个细胞条件下，在被激发的细胞中可检测到明显快速的mKate2/mKOκ比值上升，这一比值说明了在单个细胞的层面PKA能够被激活(见图3-A/B)；当细胞没有表达2pabPAC时，PKA活性无明显变化。这些结果证实了双光子能够激发组织中单细胞内的2pabPAC并生成cAMP(见图3-C)。另外，作者也在3D组织模型中表达了可检测激酶ERK活性的生物传感器Booster-ERK，验证2pabPAC是否能够激活ERK通路。双光子或单光子激发后mKate2/mKOκ的比值并未无明变化(见图3-D)，因此说明2pabPAC这一工具对于cAMP信号通路具有特异性。

图4. A)在表达以及未表达2pabPAC的小鼠肝组织中检测PKA活性；B)双光子激发表达了2pabPAC的单个细胞后，邻近细胞同样检测到了PKA活性；C)肝脏组织中激活PKA后其活性与时间及距离的关系。 

最后，作者将2pabPAC用于体内调控PKA的活性。细胞内PKA的活性蔓延(propagation)现象能够在培养的细胞中观察到，然而人们尚不清楚这一现象是否也存在于活体组织中。为了探寻这一可能性，作者尝试在小鼠中利用2pabPAC对PKA的活性进行成像观察。由于肝脏中的cAMP-PKA通路调节了包括脂质代谢与细胞分化等多种功能，因此他们将研究对象聚焦在了肝组织上。作者使用AAV2/8载体包裹2pabPAC，利用腹腔注射的方式使其进入稳定表达了Booster-PKA的小鼠体内，培养三天以上，之后将小鼠肝脏在真空下固定并用双光子显微镜进行成像。实验证明表达了2pabPAC的小鼠肝脏在单光子与双光子激发条件下都能够检测到PKA活性，而表达了突变体2pabPAC(Y72L)或未表达2pabPAC的肝脏组织在双光子激发下PKA活性并无无明显上升。有趣的是，除了激活的靶细胞，邻近的细胞内同样检测到了PKA的活性，这说明了在肝脏组织内，PKA同样会产生活性蔓延的现象。通过在不同时间下激发2pabPAC，PKA的活性在30 s之前会达到峰值，随后逐渐下降，且PKA的活性范围在半径40 um以内。这一实验结果证实了在活体组织中存在PKA活性蔓延的假设。作者认为，这一现象的发生是因为cAMP会调控分泌细胞中激素分子的胞吐现象，这可能与邻近的肝脏细胞间PKA活性蔓延有关，具体机制尚需进一步探索。

总之，本文发展了一种可在单细胞层面上调控cAMP水平的双光子激发的光遗传学工具2pabPAC，并在活体组织中实现了对单细胞cAMP-PKA信号通路的激活。这一工具也为探索cAMP-PKA相关的细胞-细胞相互作用提供了新的思路。