细菌逆转录酶在抗噬菌体防御中的作用

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逆转录酶是由一个非编码RNA（ncRNA）和一个特殊的逆转录酶（RT）组成的遗传元件。这些元件通常生成一个RNA-DNA嵌合分子，其中RNA和DNA通过2’-5’磷酸二酯键共价连接。该逆转录酶系统最初于1984年在黄色粘球菌（Myxococcus xanthus）中发现，当时人们鉴定出一种广泛分布于细菌的、短且多拷贝的单链DNA【1】，进一步的研究表明，这种单链DNA与RNA分子共价连接，随后详细地破译了导致RNA-DNA杂交体形成的生化步骤【2,3】。尽管逆转录酶系统在三十年前就被发现了，但它们的功能仍然是未知的。

2020年11月5日，以色列魏茨曼科学研究所分子遗传学系Rotem Sorek研究组在Cell 杂志上发表文章Bacterial Retrons Function In Anti-Phage Defense，揭示了广泛存在于细菌中的逆转录酶系统是抗噬菌体防御系统的一部分，其机制主要是通过阻碍噬菌体感染介导抗噬菌体活性的产生。

首先研究人员受到前期工作基础的启发在多种细菌的“防御岛”上发现了一个含有逆转录酶的保守的双基因盒，并将这个双基因系统克隆到自然缺乏该系统的菌株中发现，该系统能够抵御来自多种家族的噬菌体。

另外，研究人员发现在预测的核酸内切酶和RT基因之间可能包含一个ncRNA，通过分析RNA-seq数据证实了这一假设。进一步通过分析ncRNA二级结构发现其具有已知逆转录酶ncRNA前体的特点，并说明它真的是ssDNA合成的前体，因此新发现的这个防御系统包含一个全新的逆转录酶。

为了验证该逆转录酶的特征是否与新防御系统的抗噬菌体活性有关，研究人员对该系统进行了突变实验并证实正确的反转录是其防御功能所必需的。综上，新的防御系统由三个组成部分组成：RT、ncRNA和一个包含预测的核酸内切酶结构域的基因，并将其命名为Retron-Eco8。

之前文献报道逆转录酶系统是由RT和前体ncRNA组成的双组分系统。然而，当检查已知的逆转录酶及其同源基因的基因组环境时，研究人员发现绝大多数逆转录酶系统仅仅是作为基因盒的一部分，在基因盒中还包含一个或两个额外的蛋白质编码基因，将这些逆转录酶系统相关基因称为“效应器”，并最终发现10种与逆转录酶相关的不同类型的效应器。

接下来，研究人员将来自大肠杆菌的6个已知逆转录酶系统、大肠杆菌和霍乱弧菌编码的5个已验证的逆转录酶系统及其效应器基因一起克隆到大肠杆菌MG1655中，然后用噬菌体感染。结果显示其中8个系统至少对一个噬菌体具有显著的抗性，有的菌株的抗噬菌体活性仅限于一个噬菌体，而另一些菌株的抗噬菌体能力很强，跨越了几个不同噬菌体家族。随后，研究人员利用两个具有广谱抗噬菌体活性的逆转录系统（Ec48和Ec73），通过点突变实验证明了逆转录酶基因与其相关的效应基因一起作用形成抗噬菌体防御系统。

在CBASS抗噬菌体系统中，效应器蛋白在接收到噬菌体感染刺激后会引发细胞杀伤作用，从而导致受感染细菌的新陈代谢在噬菌体完成复制周期之前停止，这是一种常见的阻碍感染的防御策略。

然而，一些逆转录酶效应器中的蛋白结构域与CBASS抗噬菌体系统的效应器蛋白一致，因此研究人员假设逆转录酶系统也通过阻碍噬菌体感染发挥作用，并且逆转录酶效应基因可能与噬菌体感染的毒性反应有关。为验证这一假设，研究人员用不同MOI感染含有逆转录酶系统的细菌，并检测了液体培养中的感染动力学，最终证明逆转录酶系统是通过阻碍噬菌体感染来实现抗噬菌体的。接下来，以Ec48为研究对象深入探讨阻碍噬菌体感染的过程。

首先怀疑Ec48逆转录酶系统与CBASS抗噬菌体系统一样都是通过跨膜效应器使受感染细胞的细胞膜通透性改变进而使受感染的细菌在噬菌体完成其复制周期之前死亡来发挥作用。为验证这一假设，研究人员用碘化丙啶来对失去质膜完整性的细胞染色，最终说明噬菌体没有在这些细胞中完成复制周期。

最后为了阐明Ec48逆转录酶识别和减轻噬菌体感染的机制，研究人员试图找到能够逃避逆转录酶防御的噬菌体突变体，最终分离出6个λ-vir噬菌体和7个T7噬菌体的突变体。然后，通过全基因组测序比较突变体与野生噬菌体，结果显示导致噬菌体λ-vir Gam蛋白失活的突变可以使噬菌体克服逆转录酶Ec48防御系统。

另外，在逃避逆转录酶系统的T7突变体中，研究人员发现两个突变体都出现了错义突变，分别在基因1.7和基因5.9。由于以上突变位点具有相同的生物学功能即抑制一种名为RecBCD的细菌复合物，因此研究人员发现Ec48逆转录酶系统通过检测噬菌体的这些蛋白或其活性作为感知噬菌体感染的信号并最终证实Ec48逆转录酶防御系统以某种方式识别噬菌体RecBCD抑制剂，一旦识别发生，效应器的毒性就会激活从而导致噬菌体复制停止。

综上所述，该工作筛查多个细菌逆转录酶系统发现它们可以通过阻碍感染介导抗多种噬菌体的作用。最终以逆转录酶Ec48为研究对象，发现噬菌体蛋白抑制RecBCD复合物后激活逆转录酶Ec48，从而导致感染失败和细胞死亡。因此，Ec48逆转录酶形成了第二道防线，如果第一道防线坍塌，就会触发该防线。

参考文献

1. Yee, T., Furuichi, T., Inouye, S., and Inouye, M. (1984). Multicopy single- stranded DNA isolated from a gram-negative bacterium, Myxococcus xanthus. Cell 38, 203–209.

2. Dhundale, A., Lampson, B., Furuichi, T., Inouye, M., and Inouye, S. (1987). Structure of msDNA from Myxococcus xanthus: evidence for a long, self-annealing RNA precursor for the covalently linked, branched RNA. Cell 51, 1105–1112.

3. Lampson, B.C., Inouye, M., and Inouye, S. (1989). Reverse transcriptase with concomitant ribonuclease H activity in the cell-free synthesis of branched RNA-linked msDNA of Myxococcus xanthus. Cell 56, 701–707.