追踪植物细胞的膜蛋白

内容来源：中国科技论文在线

林金星（右一）与同事一起工作。 林金星供图

最近，在国家自然科学基金（项目号：31270412，31270224）等资助下，北京林业大学林金星教授团队和中科院植物研究所邓馨研究员团队合作， 在自主搭建植物细胞单分子检测平台的基础上，提出了适合植物单分子研究的算法，实现了单个膜蛋白动力学参数的精准分析。相关研究工作发表在学术期刊Nature Protocols上。

新技术“明察”植物单分子

近年来，随着生命科学的不断发展，荧光显微成像技术已经成为现代细胞生物学研究过程中必不可少的工具。然而，传统光学显微镜因为受到光学衍射极限的限制，分辨率只能达到200 纳米，远远不能满足生物学研究的需求。

1976年，科学家第一次尝试用全内反射荧光法实现了单分子荧光检测。从此，这项技术就在分析化学、生命科学等领域受到极大重视。

林金星介绍，特别是近年来，随着各种新型荧光探针和成像理论的出现，单分子检测技术（single molecule detection,SMD）打破了光学衍射极限。“将分辨率提高到了几十个纳米的水平，并且凭借其灵敏度高、检测迅速、观察精确等特点，极大推动了活细胞内反应动力学、分子 间相互作用等方面的研究。”林金星告诉《中国科学报》记者。

不过，在植物细胞研究领域，这项技术却受到了细胞壁的限制。围绕这个问题，当时在中科院植物所工作的林金星带领团队开始想办法。2005年，他们自主搭建 适合植物细胞膜蛋白动态分析的单分子检测平台，克服了细胞壁对蛋白动态分析的干扰，建立了全内反射荧光显微术（TIRFM），实现了对单个分泌囊泡运动的 实时成像。随后，通过这个平台对多个蛋白的胞吞和转运等进行了深入研究，多篇论文在著名刊物PlantCell、PNAS发表，开创了植物细胞单分子活体动态研究的新领域。

新算法“追踪”运动轨迹

在同行们看来，林金星团队通过搭建的这套平台，将荧光相关光谱和荧光交叉相关光谱技术引入植物膜蛋白研究领域，率先将这个领域推进到单分子水平。

同时，该团队还围绕分析方法开展了诸多研究。“我们通过技术参数的优化，建立了可变角度全内反射荧光显微术以及适用于植物细胞研究的分析方法，首次实现了单个质膜蛋白运动参数的精准分析，分析的精度达到纳米和毫秒级。”林金星说。

多年来，在团队研究人员的努力下，他们逐渐发展了一套适合植物膜蛋白共定位分析的单颗粒连续追踪分析方法，实现了不同时间序列蛋白互作的定量分析。

在此基础上，他们又针对多假设追踪（Multiple hypothesis tracking,MHT）算法，在多目标关联跟踪过程中计算量大的问题，提出了一种改进的多假设跟踪算法。这一算法创造性地运用“单颗粒追踪”中的轨迹预测方法，成功地 “追踪”了植物细胞单个膜蛋白的运动轨迹。

林金星介绍，“单颗粒追踪”中的轨迹预测是一种线性、无偏、最小方差统计估值方法。研究人员通过修改假设生成、假设删除、新目标初始化、交叉目标关联，结 合植物细胞荧光成像的特点，用MATLAB实现了算法、简化了运算，提高了运算速度。最近，NatureProtocols以“单分子荧光成像技术在植物活细胞膜蛋白动力学特征和寡聚化状态定量分析中的应用”为题报道了这一新算法。

“这一算法将单个膜蛋白运动参数的分析精度提高到纳米和毫秒级，为进一步揭示植物细胞膜蛋白通过不同聚合方式和侧向运动实现自我活性调节的机制奠定了基础。”林金星表示。

基金“雪中送炭”

上世纪90年代正值我国科研经费短缺时期，作为中科院植物所当时最年轻的研究员，林金星带领的团队研究条件也十分困难，面临科研启动和工资发放等诸多问题。直到2002年，林金星获得了“国家杰出青年基金”资助，可谓“雪中送炭”。

“‘杰青’的资助为我们开展进一步研究奠定了基础。”林金星回忆，获得“杰青”不久后，他还获得了中科院“百人计划”的资助。随后，他就开始带领团队“勒 紧裤腰带”，“集中精力去做看准的事情”。在妻子的支持下，他还从“百人计划”购房资金中，拿出5万元投入到仪器的购置上。

2005年，在中科院化学所研究员方晓红等的帮助下，世界上第一台植物学科领域“全内反射荧光显微镜”在林金星的实验室成功开发。“如果把细胞比喻成一座 房子，蛋白就是一块砖头。”林金星说，“从原理上来说，以前测量蛋白的质量，通常需要把‘房子’中的许多类‘砖头’粉碎后，来测量一块砖头的平均值。”有 了这台“全内反射荧光显微镜”后，便可以从活体上测量具有不同大小每一块“砖头”的质量了，能在具有细胞壁的植物细胞中开展膜蛋白单分子开展研究。

而谈起与同事并肩奋斗、搭建仪器的日子，林金星说：“那个时候大家都没想那么多，就是单纯想通过搭建新设备作好独特且一流的研究。”

2007年，林金星获得了科学基金面上项目的支持。2015年，由林金星主持的“囊泡转运活体动态监测”获得了科学基金重点项目的支持，让他将自主开发的新平台、新算法运用到具体科学问题中。

“基金对我们开展系列研究的帮助非常大。”林金星表示，“我的科研生涯离不开基金的支持。”