张鹍等揭示畸胎瘤作为多谱系人体胚胎发育模型的潜力

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尽管发育生物学已经发展了数百年，我们对于人类早期胚胎发育的认知依旧有限。由于研究材料及科学伦理的限制，目前的发育生物学研究主要局限于各种模式动物。总体上，不同物种的发育过程具有一定的保守性，但是在某些方面也存在一些物种特异性，比如人的神经组织的发育与小鼠有很大的差别。人体多能干细胞，包括诱导多能干细胞的出现使得人们能够直接在体外研究细胞的分化过程，甚至通过CRISPR技术筛选各谱系发育关键的调控因子。

然而，这些研究大都是在培养皿中培养细胞，即二维结构，与胚胎在体内的发育过程相去甚远。为了克服这一障碍进而直接研究人类的早期胚胎发育，近些年研究人员利用人体多能干细胞开发出了一系列的三维类器官模型，用以模拟不同的发育时期。但是，这些类器官模型通常局限于特定的细胞谱系。

2020年11月4日，加州大学圣地亚哥分校的Prashant Mali 教授与张鹍教授合作在Cell上发表了文章Defining the Teratoma as a Model for Multi-lineage Human Development，揭示了畸胎瘤成为多谱系人体细胞发育分化模型的潜能。

畸胎瘤是由人体多能干细胞直接注射到免疫缺陷小鼠中直接形成的具有血管组织的复杂结构，一般能够涵盖胚胎的三个胚层，即内胚层、中胚层以及外胚层。能否在畸胎瘤中形成三胚层混合的结构也一度成为鉴定干细胞多能性的黄金标准。虽然个别研究组曾经通过特定方法从畸胎瘤中分离出了少数特定的细胞谱系，但是总体而言畸胎瘤的生长具有很大的随机性，各谱系的细胞通常混合在一起。为了克服这个问题，研究人员设想通过单细胞测序技术在单细胞水平上对畸胎瘤进行分析，并且通过CRISPR技术操纵基因表达，研究各谱系分化原理，进而优化畸胎瘤的建立过程，使其成为研究早期胚胎发育的利器。

首先，研究人员在单细胞水平上对畸胎瘤进行了完整的表征。他们将人体胚胎干细胞（H1）注射到Rag2和yC敲除的免疫缺陷小鼠中，大约70天后再将形成的畸胎瘤取除进行单细胞分析，得到了属于三个胚层的合计23个细胞类型。而这些细胞类型与小鼠的早期器官形成的细胞图谱对比分析发现，两者具有较高的相似性，侧面证明了畸胎瘤作为早期胚胎发育模型的潜能。同时也有少量的细胞类型与小鼠的细胞图谱不尽相同。例如畸胎瘤中的造血干细胞与小鼠的内皮细胞较为相似，提示小鼠的内皮细胞可能来源于造血干细胞。

随后，研究人员进一步分析了来源于不同干细胞的畸胎瘤的异质性。除胚胎干细胞H1外，他们将另外两株人体胚胎干细胞（H9/HUES62）以及人体诱导多能干细胞PGP1 iPSC注射到小鼠体内并获得畸胎瘤进行单细胞测序。结果表明，不同来源的畸胎瘤都包含了主要的细胞类群，但是在具体的细胞类群结构比例及畸胎瘤生长速度等方面存在一定的差异。进一步分析发现，这些畸胎瘤主要由外胚层及中胚层细胞构成，所含有的内胚层细胞较少，这与斑马鱼和小鼠的早期胚胎具有一定的相似性。

为了确定注射进小鼠体内的人体干细胞有多少比例最后形成了畸胎瘤以及不同细胞在形成畸胎瘤的过程中是否具有谱系偏好性，研究人员利用腺病毒将一段带有条形码的DNA序列提前整合到干细胞中，以便于形成畸胎瘤后从单细胞测序数据中追踪原始细胞。他们发现大约有20%的干细胞参与了畸胎瘤的形成过程，并且视网膜的上皮细胞具有很强的偏好性，即这些细胞在早期是由特定的一些干细胞增殖分化而来。同时，视网膜上皮细胞的比例在不同的畸胎瘤中差异较大，说明其形成具有较高的随机性。

鉴于畸胎瘤形成过程具有一定的随机性，研究人员进一步表征了其各谱系细胞所对应的胚胎发育时期。以神经细胞为例，他们单独分析了畸胎瘤中的神经谱系相关细胞，并且进一步细化了细胞类群，鉴定出了中间神经元等新的细胞类型。通过与真实胚胎中鉴定出来的2300个相同神经谱系细胞进行对比分析，研究人员成功将畸胎瘤中的细胞投射到对应的胚胎发育时期，并且发现畸胎瘤中的神经细胞与16-17周胎儿的细胞最为接近。与此同时，结果表明畸胎瘤中的神经细胞主要是早期神经元、放射性神经胶质细胞及祖细胞，而成熟的神经元很少。最后，他们通过RNAscope的技术在畸胎瘤中确认了相关细胞谱系的存在及其空间分布。

最后，为了展现畸胎瘤作为多谱系分化模型的重要应用，研究人员选择了与胚胎发育密切相关的24个基因进行敲除实验。他们首先针对每个基因设计了两条gRNAs并且验证其敲除效率，最后选择了16条gRNAs进行实验。与对照组相比，特定基因敲除的诱导多能干细胞产生的畸胎瘤在细胞的类型及比例上都出现了一定的变化。例如，已有的研究发现TWIST1基因对于中胚层细胞的分化有抑制作用，但是能促进神经上皮细胞的扩增，而由敲除TWIST1的干细胞得到的畸胎瘤中中胚层细胞比例显著减少，神经元和视网膜上皮细胞显著增加。

通过TWIST1, CDX2, RUNX1, TCF4, MECP2以及L1CAM 几个例子，研究人员充分展现了畸胎瘤用于研究一个基因在多种细胞类型完全不同功能的强大优势。此外，研究人员还利用细胞特异性的非编码小RNA（miRNA）对畸胎瘤做分子雕刻(molecular sculpting)的思路。简而言之，研究人员将miRNA的结合位点放在与自杀基因（编码具有细胞毒性的蛋白）相同的转录本上。在被导入细胞后，高表达对应miRNA的细胞能够抑制自杀基因的表达而低表达或者不表达对应miRNA的细胞则会被杀死。

研究人员选取了神经细胞特异性的miRNA124作为靶标，将其导入到干细胞中，最后发现在畸胎瘤中成功富集了神经细胞。这个基于合成生物学原理设计的自杀基因模块具有很广泛的通用性。简单的把miRNA124的结合位点换成其他细胞或者组织特异表达的miRNA，畸胎瘤可以灵活塑造成不同的细胞组织结构。这将成为新一代的人体细胞组织工程以及合成生物学研究的有效利器之一。

总之，该研究通过高通量的单细胞测序对畸胎瘤进行了全方位的详尽表征，并且利用CRISPR技术进行基因编辑，证明了畸胎瘤作为研究早期胚胎发育模型的重要意义，最后提供了优化畸胎瘤模型，纯化特定谱系的潜在方法。然而，畸胎瘤由于其本身的特性，作为发育模型的局限性依旧存在。例如，其生长过程中的随机性导致的不同批次的畸胎瘤的异质性以及各谱系分化的不同步。为了达到足够的可靠性，需要分析多个不同的畸胎瘤。另外单个时间点获取的畸胎瘤还不能完全代表人体胚胎发发育的不同阶段，今后还需要对畸胎瘤演化的不同时间点做更详细的研究。