疗效差？毒性大？B细胞恶性肿瘤的CAR-T免疫治疗或可出现新进展

来源：BioArt

一个多世纪以来，免疫学已被用于治疗恶性肿瘤，如单克隆抗体、双特异性抗体、肿瘤疫苗、免疫检查点阻断剂、细胞因子诱导杀死药（CIK）、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），以及近些年来兴起的嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞治疗等。CAR是由细胞外单链可变片段（scFv）、跨膜结构域，以及胞内部分——免疫受体基于酪氨酸的激活基序（ITAM）和共刺激信号组成的合成受体。scFv负责识别并结合肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原（TAA），而其胞内结构域则在T细胞的激活、增殖、持续和细胞毒性中起着关键作用。CAR的结构与T细胞受体（TCR）相似，但CAR的scFv对TAA的识别不依赖于主要组织相容性复合体（MHC），可以靶向肿瘤细胞表面表达的多种抗原，包括蛋白质、碳水化合物和神经节苷脂【1】。

目前，以CD19为靶点的CAR-T细胞治疗已被证明对复发性、难治性B细胞恶性肿瘤如B细胞非霍奇金淋巴瘤（NHL）、急性淋巴细胞白血病（ALL）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）有显著的治疗作用【2,3】。虽然抗CD19 CAR-T细胞治疗的早期结果令人欣喜，但是只有不到一半的患者出现了长期的缓解，这意味着大多数患者在接受治疗后要么没有反应要么出现了复发。此外CAR-T细胞治疗中常见的副作用——细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）也对一些病人产生着严重影响。同时，自体抗CD19 CAR-T细胞治疗3个月后，影像学显示完全缓解（CR）或部分缓解（PR）的大B细胞淋巴瘤（LBCL）患者的预后明显优于在此之前患有稳定疾病（SD）或进行性疾病（PD）的患者。那么CAR-T细胞治疗在不同患者中出现的这些差异的原因到底是什么呢？

近日，来自德克萨斯大学MD安德森癌症中心的Michael R. Green和Linghua Wang团队在Nature Medicine在线发表题为Characteristics of anti-CD19 CAR T cell infusion products associated with efficacy and toxicity in patients with large B cell lymphomas 的文章，对24例LBCL患者的自体抗CD19-CAR-T细胞药物（axicabtagene ciloleucel，Axi-cel）输注产物采用10x Genomics单细胞免疫分析解决方案在同一个单细胞中同时进行全转录组基因表达分析及V（D）J分析，以确定与疗效和毒性相关的转录组学特征，确定了CAR-T细胞输注产物在细胞和分子上与临床反应、分子反应和3或4级ICANS （ICANSgr3-4）发展相关的特征，为CAR-T细胞治疗疗效和毒性的患者间差异提供了新的细胞和分子基础。24例LBCL患者输注自体CAR-T细胞后，研究人员对137,326个残留的细胞进行了全转录组scRNA-seq。同时，研究人员采用了标记基因的杂交捕获测序和来自scRNA-seq数据库的CAR构建序列，并通过共享的邻近聚类改进CD4和CD8的分类，即CapID+方法，以此来改善scRNA-seq分析，从而精确分配CAR状态和细胞基因表达（图1）。

图1 工作流程图

在使用正电子发射断层扫描/计算机断层扫描术（PET/CT）的3个月（一个临床相关的替代时间点，用于预测LBCL患者Axi-cel治疗后反应的长期持久性）随访中，13名患者仍为进行性疾病（PD，50%），1名患者部分缓解（PR，4%），9名患者完全缓解（CR，38%），1名患者无法评估。比较CR患者和PR/PD患者输注产物的细胞类型和功能状态，研究人员发现PR/PD患者的输注产物中衰竭的CD8和CD4 T细胞显著富集，而CR患者的输注产物中记忆CD8 T细胞显著富集。CR患者和PR/PD患者CD8 T细胞的差异表达基因（DEG）鉴定出4类细胞群，这些差异表达基因大多与CD8 T细胞的激活和衰竭有关，虽然每个细胞群都包含来自所有患者的细胞，但是来自CR患者的细胞的相对比例在各个细胞群之间存在显著差异。CD4 T细胞的DEG分析和聚类也表现出类似结果，不同的是增殖相关基因和周期细胞在CR患者的高频细胞聚类中表达较高。由此强调了与临床疗效相关的CAR-T细胞输注产物细胞的重要转录特征。

抗原驱动的CAR-T细胞扩增将在Axi-cel输注后约1周达到峰值，因此，研究人员认为在治疗的第一周内对反应动力学的评估可能会对CAR-T细胞的临床活性提供指向。于是，研究人员利用血浆来源的细胞游离DNA（cfDNA）测序来确定早期分子反应（EMR），结果显示输注后第7天的分子反应与临床反应显著相关。同时结合单细胞T细胞受体（TCR）测序（TCR具有细胞特异性，是T细胞的一种分子标记，被广泛用于监测T细胞的克隆类型和多样性，该测序方法可富集并对TCR的α和β链同时进行测序）发现CD8 T细胞衰竭的标志物与EMR不良相关，EMR不良患者TCR克隆型多样性略有降低，CD8 T细胞衰竭信号的频率明显增高，表现为LAG3+TIM3+细胞比例增加（这也是Axi-cel CAR-T细胞治疗进展患者瘤内CD8 T细胞比例过高的一个特征）。进一步的，研究人员期图鉴别出与相关毒性反应显著相关的CAR-T细胞输注产物的特征。研究人员在ICANSgr3-4患者的输注产物中发现了一小群细胞显著高表达，称为ICANS相关细胞（IAC）。与其他细胞聚类相比，IAC具有单核细胞样转录特征，其CAR表达、TCR重排、CD3D表达和CD8B表达显著降低。

综上所述，本研究表明输注的CAR T细胞产物的细胞和分子多样性是导致经抗CD19-CAR-T细胞治疗的LBCL患者疗效和毒性差异的主要因素，与输注产物相关的可量化表型可通过在其产生过程中富集所需的、或消除不期望的细胞群体或功能状态而发挥作用。对离散细胞群导致反应不良或高毒性的机制的了解，可能有助于发现治疗干预的途径，从而提高疗效，降低CAR-T细胞输注后的毒性。

当然，虽然上述研究从单细胞层面全面揭示了抗CD19-CAR-T细胞治疗对B细胞恶性肿瘤患者的疗效和毒性差异的机制，但是在这之前已知的大多数NHL患者对抗CD19 CAR-T细胞治疗无反应或复发的一个普遍机制在于CD19抗原的下调和CD19阴性（CD19-）克隆的产生。

为了解决这个问题，在同期Nature Medicine杂志上，来自美国威斯康星医学院的Nirav N. Shah团队也在线发表题为 Bispecific anti-CD20, anti-CD19 CAR T cells for relapsed B cell malignancies: a phase 1 dose escalation and expansion trial 的文章，首次在人类试验中使用双特异性抗CD20、抗CD19（LV20.19）CAR T细胞治疗复发性难治性B细胞恶性肿瘤，对NHL和CLL患者进行了1期剂量递增和扩大试验（NCT03019055），报告了使用CliniMACS Prodigy设备现场制备并输注非冷冻保存的LV20.19 CAR T细胞治疗的可行性和安全性，并且在每公斤2.5×106个细胞的输注剂量下显示出低毒性和高效性。值得注意的是双重靶向减轻了原来治疗失败时CD19的下调，表明该方法有可能可以通过减少抗原逃逸耐药机制来改善CAR T细胞治疗的临床结果。总而言之，Nature Medicine背靠背报道的工作共同填补了人们对抗CD19 CAR T细胞治疗中出现的疗效和毒性反应差异的理解上的空白，为B细胞恶性肿瘤的免疫治疗的临床结果提出了机制上的见解和可行的解决方案，不可不谓是浓墨重彩的一笔！