王嘉东/王巍/申占龙合作揭示PD-1蛋白水平稳态调控机制

来源：BioArt

近年来，PD-1相关免疫检查点抑制疗法在临床上取得了令人瞩目的成就，成功地应用于多种恶性肿瘤的治疗中【1】。但是目前仍存在低响应率和耐药性等问题，限制了该疗法的进一步应用【2】。这就要求我们对相关分子机制进行进一步的研究。与之相关的，为了增加PD-1相关疗法的效果，人们尝试将PD-1相关治疗与放疗/化疗/靶向治疗联合使用，也已经在一些癌症中被证明具有更好的疗效。但是，联合治疗为何会有更好疗效的机制仍不完全清楚，因此不利于现有治疗方案的改进与更多联用疗法的开发【3】。

目前人们已经知道PD-1的表达在细胞中受到多重调控。细胞膜表面的PD-1可以抑制效应T细胞的活性，PD-1的过量表达在肿瘤免疫逃逸中起关键作用；不过同时PD-1如果不能正常表达也可能会影响急性炎症的消退以及胸腺和外周的免疫耐受【4】。因此，维持适当水平的PD-1表达具有重要意义。2018年，许琛琦课题组在Nature发表论文报道了在T细胞激活约两天后，FBXO38可以降解从细胞膜内化后的PD-1蛋白，解释了PD-1蛋白最终是如何降解的【5】。而在转录层面，人们已经发现超过10种转录因子复合物以及表观遗传学调节因子共同组成了复杂的PD-1转录调控网络，说明在细胞内PD-1的表达确实受到了精确的调控【6】。

但细胞是如何在复杂的生理情况下维持细胞膜表面PD-1蛋白水平稳态，尤其是放化疗以及病理状态是否会破坏PD-1蛋白稳态维持，仍有待进一步研究，阐明这些问题可以使我们对PD-1蛋白水平的调控有更深的理解，同时为进一步改进相关疗法提供新的信息。

2020年10月27日，北京大学基础医学院王嘉东组与基础医学院王巍组、北京大学人民医院申占龙组合作在PNAS发表文章“KLHL22 maintains PD-1 homeostasis and prevents excessive T cell suppression”，报道了KLHL22可以降解未完全糖基化的PD-1，使其无法在细胞表面过度积聚，从而维持PD-1蛋白水平稳态，防止T细胞活性过度抑制。而在肿瘤微环境或5-FU治疗的情况下，KLHL22维持PD-1表达稳态机制的失效可能导致PD-1的过度积聚以及T细胞活性的降低。该研究加深了目前对于PD-1蛋白相关调控的认识，也部分解释了5-FU与PD-1单抗联用效果更好的机制，为临床疗法的改进提供了参考。

在该研究中，作者们首先分别在Jurkat与293T细胞中纯化过表达的PD-1并进行质谱分析。结合数据库，作者们发现在两个质谱结果中KLHL22蛋白都得到了明显的特异性富集，紧接着分别在Jurkat、293T以及人PBMC中都验证了KLHL22与PD-1有非常明显的相互作用，这提示KLHL22可能是一个重要的PD-1相关蛋白。KLHL22是E3泛素连接酶KLHL22-CUL3-RBX1复合体的一部分，主要行使特异性识别底物的功能【7】，而介导泛素-蛋白酶体途径的降解是蛋白泛素化的重要功能，因此研究者首先测试了KLHL22是否可以影响PD-1的表达。研究者发现在细胞中敲低KLHL22可以明显观察到细胞膜上PD-1蛋白水平的上升，作者们进一步构建了KLHL22 KO的小鼠，发现在KO小鼠T细胞表面也存在PD-1的过度积聚，提示KLHL22很有可能介导了PD-1的降解。进一步的肿瘤模型实验发现KLHL22 KO小鼠与WT小鼠相比有着更快的肿瘤进展速率，而PD-1单抗治疗可以消除KLHL22缺失对小鼠体内肿瘤生长的促进作用。这提示KLHL22缺失的小鼠主要是由于PD-1的高表达导致肿瘤快速进展。

但是与此同时研究者们发现了一个有趣的现象，在PBMC细胞中，无论是否被CD3/CD28抗体激活，KLHL22都没有明显的细胞膜定位，因此研究者猜想KLHL22可能不是直接降解定位在细胞膜上的PD-1。为了验证这个猜想作者们首先使用了内质网-高尔基体转运抑制剂BFA，验证KLHL22是否可以在PD-1定位在细胞膜上之前就将其降解。发现在加入BFA之后WB可以观察到一个未完全糖基化的PD-1条带，并且该条带在KLHL22特异性敲低之后可以大量积累。之后研究者们又通过一系列实验证明了KLHL22可以与未完全糖基化的PD-1相互作用并且介导其通过泛素-蛋白酶体途径降解。由于KLHL22对PD-1的调控作用发生在各种转录调控机制之后，但是同时是在PD-1发挥作用之前。因此作者意识到这种机制的特殊性提示KLHL22可能在细胞内发挥了控制PD-1的表达量，防止其过度表达的作用，从而维持PD-1蛋白水平稳态。

在急性刺激条件下，T细胞PD-1会迅速表达，研究者测试了在这种情况下KLHL22的表达并发现PD-1表达上调的同时KLHL22表达也同时上调，防止PD-1在细胞膜上的过度积累，从而维持PD-1蛋白水平的稳态。而在KLHL22缺失的情况下，PD-1会在膜上过度积累，抑制效应T细胞活性。

那这种调控机制是否会在各种病理生理条件下受影响呢？人们已经知道在肿瘤浸润T细胞中PD-1处于异常高表达状态，研究者发现在肿瘤浸润T细胞中的KLHL22确实处于低表达状态，并且在105例结直肠癌病人样品中得到了验证。有趣的是，许琛琦课题组报道FBXO38在肿瘤浸润T细胞中也处于低表达状态，与本文一起提示蛋白降解途径受阻可能是肿瘤浸润T细胞中PD-1高表达的重要原因【5】。

除此之外，目前肿瘤免疫治疗领域的一个重要问题是，免疫疗法与放疗或化疗的联用已经在一些癌症中被证明具有更好的疗效，但是联合治疗为何会有更好疗效的机制仍不完全清楚，这也不利于现有联用疗法的改进和更多联用疗法的开发。那么，除了肿瘤微环境之外，传统放化疗是否会通过影响PD-1的蛋白水平稳态最终影响肿瘤免疫呢？

因此研究者测试了多种传统放化疗条件，发现传统一线化疗药物5-FU可以通过抑制KLHL22的表达从而使PD-1的表达升高。研究团队与临床医院合作进一步发现，与未经过新辅助化疗的病人相比，经过包含5-FU 的新辅助化疗的病人，其肿瘤浸润T细胞呈现KLHL22低表达同时PD-1高表达的状态。这提示了5-FU与PD-1抗体联用可能会在临床上取得比较好的效果。

总之，该研究揭示了KLHL22在维持适当的PD-1表达水平和调节肿瘤免疫中的重要作用。KLHL22通过降解未完全糖基化的PD-1防止PD-1在细胞表面过度积聚。而这种降解作用在肿瘤微环境中或5-FU治疗情况下的失效会导致PD-1积累过多和T细胞活性降低。综上所述，该研究揭示了维持PD-1蛋白水平稳态的机制，也部分解释了5-FU与PD-1单抗联用效果更好的机制，为临床疗法的改进提供了参考。