Nature ： Fanconi Anaemia单泛素连接酶复合物的结构解析

来源：BioArt

FA核心复合物由8个亚单位组成：FANCA、FANCB、FANCC、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL和FAAP100。E3泛素连接酶FANCL含有一个环指结构域（RING-finger domain）并且可与FANCB、FAAP100构成催化模块【1】。FANCA和FANCG是染色质靶向模块，FANCC、FANCE和FANCF形成底物识别模块【2】。Fanconi anaemia（FA）通路参与修复内源性和化疗诱导DNA交联引起的DNA损伤，并对复制应激发生响应。FA通路的失活突变会损害发育，抑制造血、促进癌症发生发展。当DNA损伤发生时，FA核心复合物——多蛋白E3泛素连接酶对异二聚体FANCD2-FANCI的FANCD2的K561位点进行单泛素化修饰。激活的FANCD2结合到染色质和BRCA1、BRCA2-FANCD1蛋白复合体组成的DNA修复灶。BRCA2/FANCD1直接结合RAD51和DNA，参与同源介导的DNA修复【3】，去除DNA交联或者稳定暂停的复制叉。FA核心复合物在DNA修复过程中起重要作用，但我们对于FANCL如何加入到复合物并对FANCD2-FANCI底物进行位点特异的单泛素化修饰，以及突变如何破坏复合物的功能等缺乏分子层面的理解。

2019年10月31日，来自英国剑桥的Lori A. Passmore在Nature杂志发表文章，Structure of the Fanconi anaemia monoubiquitin ligase complex，使用冷冻电镜和质谱技术解析了FA核心复合物的结构，2个FANCB-FAAP100二聚体组成中心，两侧是FANCL的环指结构。这2个异三聚体作为支架，便于其余的5个亚单位进行组装，并构成一个扩展性不对称性结构。FANCB、FANCL和FAAP100突变将会导致支架的不稳定，进而破坏整个复合物，导致FA通路的失活。此外，FANCB和FAAP100虽然缺乏序列上同源性，但结构上具有类似性；2个FANCL亚单位在复合物相对的两端具有不同的构象，表明每个FANCL具有不同的功能，而且这种二聚环指结构域在结构和功能的不对称性可能是E3泛素连接酶的普遍特征。

研究人员在昆虫细胞中过表达鸡源（Gallus gallus）FA核心复合物的8个亚单位，并纯化重组成具有活性的完整复合物，能够特异性对FANCD2而不是FANCI进行单泛素化修饰。冷冻电镜显示FA核心复合物是约25nm的细长结构，经过3D重构得到分辨率为4.2Å的结构。外围区域由于构象的灵活性其分辨率要低于中间核心区域。分析发现，FA结构分为三部分：顶部、中间部份和基底。基底包含底物识别模块（FANCC、FANCE和FANCF），而从中心伸出的臂可能是FANCG，催化模块（FANCB、FANCL和FAAP100）组成中间部分。利用交联质谱技术检测距离相近的残基，显示834个分子间和分子内交联，其中40%位于FANCB、FANCL和FAAP100，与三者形成紧密复合物中心是一致的。综合利用冷冻电镜、质谱、交联质谱、同源模拟和二级结构预测等数据，构建了一个包含所有FA核心复合物亚单位（除FANCA之外）的结构模型。

FA结构显示2个FANCB-FAAP100异二聚体位于中间区域，并伸出长α螺旋组成2对卷曲螺旋（coiled coils），将中心的β链与螺旋束连接起来。在卷曲螺旋的外周端有配对的β螺旋桨，来自FANCB或FAAP100的N端结构域，其中FANCB的β螺旋桨靠近卷曲螺旋，FAAP100的β螺旋桨靠近FANL的ELF结构域。尽管FANCB和FAAP100没有序列的同源性，但两者在整体结构和结构域组织上非常相似。FANCL由ELF、URD、环指结构域构成，位于复合物的基底，而且其与FANCB-FAAP100卷曲螺旋有相互作用。FANCG含有四肽重复序列（tetratricopeptide repeats，TPRs），与中心的FANCB-FAAP100二聚体相交联，对FANCA与FA核心复合物的结合是必需的。FANCG和催化模块间有个通道。底物识别模块（FANCC、FANCE和FANCF）位于基底，组成α螺旋弧，FANCF处于螺旋弧的中心位置。FANCL的环指结构、ELF结构域和FANCE、FANCF相互作用，FANCL的URD结构域和FANCC、FANCE相互作用，FANCC的C端结构域和FANCE非常靠近。

二聚化对一些E3泛素连接酶的活性是必需的，如Rad18、RNF8、CHIP等同源二聚体和BRCA1-BARD1、Ring1b-Bmi1异源二聚体。这些都包含2个环指结构-U盒结构，以非对称的方式排列，而且仅有一个功能性E2结合位点。因此，结构和功能的非对称性可能是E3泛素连接酶的通用特征。FANCL的一个环指结构可能有结构上功能，促进底物和FANCE的结合，另一个环指结构可能是E3催化中心，促进泛素基团转移到底物FANCD2。此外，FA病人中检测到的大部分FA复合物突变导致蛋白截短，而且发生在FA核心复合物结构的周边，仍然残留单泛素化连接酶的活性，保留部分活性；但携带FANCB或FANCL突变可能破坏催化模块和支架结构，病人受到严重影响。

总的来说，该研究构建了FA核心复合物的结构模型，揭示了FA识别并催化底物的分子结构机制，为理解FA的E3泛素连接酶活性和DNA链间交联修复提供基础。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1703-4

参考文献

1. Rajendra, E. et al. The genetic and biochemical basis of FANCD2 monoubiquitination. Mol. Cell 54, 858–869 (2014).

2. van Twest, S. et al. Mechanism of ubiquitination and deubiquitination in the Fanconi anemia pathway. Mol. Cell 65, 247–259 (2017).

3. D'Andrea, A. D. & Grompe, M. The Fanconi anaemia/BRCA pathway. Nat Rev Cancer 3, 23-34, doi:10.1038/nrc970 (2003).