蛋白质设施用户及其合作者揭示疱疹病毒抑制宿主mRNA出核转运的分子机制

2020年10月8日，国家蛋白质科学研究（上海）设施用户中科院生物物理所高璞课题组和邓红雨课题组合作在PNAS上发表题为Molecular mechanism underlying selective inhibition of mRNA nuclear export by herpesvirus protein ORF10的研究工作，该研究综合运用生物化学、结构生物学及细胞生物学手段，解析了γ疱疹病毒ORF10与宿主mRNA转运复合物Rae1-Nup98的互作细节，确认了ORF10的RNA结合能力及其重要功能，并揭示了ORF10选择性抑制mRNA出核转运的作用机理。  

病毒在与宿主长期的博弈过程中，进化出了多种机制来对抗和逃避宿主的抗病毒反应。其中，通过干预宿主的mRNA出核转运过程，进而阻止宿主细胞建立合适的抗病毒环境，是其中的一个重要策略。比如，甲型流感病毒NS1蛋白和水疱性口炎病毒的M蛋白均被发现可以广谱抑制宿主mRNA出核转运。2016年的一项研究发现，γ疱疹病毒（如卡波西肉瘤相关病毒KSHV和鼠γ疱疹病毒MHV68）编码的ORF10蛋白，可以通过与宿主mRNA转运复合物Rae1-Nup98相互作用，特异性抑制部分宿主mRNA的出核转运。值得一提的是，ORF10是疱疹病毒中第一个被发现可以抑制宿主mRNA出核转运的毒力蛋白，也是目前报道的第一个能选择性抑制特定mRNA转运的病毒蛋白。然而，ORF10与Rae1-Nup98复合物互作的结构基础，以及ORF10发挥抑制功能的分子机制，目前仍不清楚。  

研究人员利用昆虫细胞表达系统，制备了状态良好的ORF10-Rae1-Nup98三元复合物样品，并成功解析了该复合物2.5？分辨率的晶体结构。结构分析发现，ORF10与Rae1-Nup98复合物存在两个主要的互作界面。在这两个互作界面中，ORF10两个高度保守的氨基酸L60和M413贡献了重要的疏水相互作用。通过Co-IP、体外Pull-down、GFP报告基因的表达测定、GFP-mRNA的核质分布测定、RNA FISH成像等多种生化细胞实验， 研究人员明确了L60和M413对维持ORF10与Rae1-Nup98的相互作用、以及对维持ORF10的mRNA出核转运抑制功能都至关重要。 

ORF10-Rae1-Nup98复合物结构、互作细节、及突变体对GFP报告基因表达的影响  

有意思的是，虽然ORF10占据了Rae1-Nup98复合物自身的RNA结合口袋，但是ORF10-Rae1-Nup98三元复合物却依然保持着足够强的RNA结合能力。研究人员推测ORF10本身可能也具备与RNA的直接结合能力。的确，后续生化实验证实了ORF10可以直接结合RNA。通过对ORF10表面的正电荷聚集区进行系统突变，确定了其结合RNA的位点，并发现ORF10与RNA的互作对其发挥抑制mRNA出核转运的功能非常关键。 

ORF10表面电荷分布，以及突变体对GFP报告基因表达的影响  

综上，作者解析了γ疱疹病毒ORF10蛋白与宿主mRNA出核转运复合物Rae1-Nup98的三元复合物结构，明确了两个重要的病毒-宿主互作界面及关键氨基酸，发现了ORF10直接结合RNA的能力及其对抑制宿主功能的重要性。另外，此项工作还意外发现，完全不同的病毒蛋白（如γ疱疹病毒的ORF10蛋白和水疱性口炎病毒的M蛋白）都可以结合到Rae1-Nup98的RNA结合口袋，这提示了该位点的重要性，也为设计新的抗病毒疗法提供了思路。  

国家蛋白质科学研究（上海）设施BL17B1线站、BL18U1线站及BL19U1线站工作人员为X射线晶体学衍射数据收集提供了及时有效的支持。  
（蛋白质上海设施提供） 

内容来源：中国科学院重大科技基础设施共享服务平台