Nat Methods：新型红色荧光和第二代绿色荧光多巴胺探针的开发及应用

来源：BioArt

多巴胺（Dopamine, DA）作为大脑中重要的神经递质，与运动控制、动机、学习、记忆、情绪等生理过程，以及多种神经系统疾病如帕金森病、成瘾、精神分裂症、多动症和创伤后压力综合征等密切相关。为更好地研究多巴胺在生理和病理过程中的作用，研究人员需要一种能够实时、灵敏、特异地检测多巴胺的工具，以研究在活体模式生物中、复杂行为模式下多巴胺信号的动态变化情况。自2018年起，北京大学李毓龙实验室开发了一系列检测神经递质的荧光探针，即GRAB探针系列，其中即包括多巴胺探针（GRABDA）。该探针克服了已有多巴胺检测手段中时空分辨率低、分子特异性差等诸多问题，已被广泛地应用于活体果蝇、小鼠、斑马鱼、斑马雀等模式生物【1-4】。

2020年10月21日，北京大学李毓龙实验室、纽约大学Dayu Lin实验室和美国国立卫生研究院Guohong Cui实验室合作在Nature Methods杂志在线发表了题为“Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo”的研究论文，报告了新型红色荧光多巴胺探针和第二代绿色荧光多巴胺探针的开发及应用。

研究者在发表的第一代探针的基础上，对多巴胺探针进行了进一步的改造和优化。本工作的亮点之一为开发出新型的具有红色荧光的多巴胺探针（rGRABDA1m和rGRABDA1h），可与其他绿色荧光探针（如钙离子探针，神经递质探针等）共同使用，实现多种信号的同时记录。工作亮点之二为优化出具有更高灵敏度及成像信噪比的第二代绿色荧光多巴胺探针（GRABDA2m和GRABDA2h）（图1），其较第一代探针在反应幅度上提升了2-3倍。

图1. 新型红色荧光多巴胺探针和第二代绿色荧光多巴胺探针在HEK293T细胞中的荧光响应情况

针对新一代多巴胺探针，研究者在细胞、脑片、果蝇（图2）、小鼠（图3）中对其表现进行了系统地刻画，并通过一系列对照实验对探针信号的特异性进行了验证，为该工具的未来应用提供了详尽的信息。应用新一代灵敏的多巴胺探针，研究者在清醒的、自由活动的动物深部脑区中记录了多巴胺的动态变化，并研究了多巴胺随着动物不同精细行为过程发展而产生的变化（图3）。

图2. 通过双光子成像法检测果蝇大脑中由气味刺激和电刺激引发的多巴胺释放

图3. 通过光纤记录法检测小鼠交配行为中NAc脑区的多巴胺动态变化情况

这些新型多巴胺探针不仅为多巴胺功能的研究提供了重要工具，也为将来开发具有多种光谱范围以及更高信噪比的神经递质探针提供了宝贵经验。“基于G蛋白偶联受体”这一探针开发策略已被成功应用于开发多种神经递质探针，包括乙酰胆碱探针【5,6】、去甲肾上腺素探针【7】、腺苷探针【8】、五羟色胺探针【9】、内源大麻素探针【10】、美国加州大学戴维斯分校Lin Tian实验室开发的多巴胺探针等【11,12】。我们期待未来将会有更多具有更高信噪比、多种光谱范围的神经递质探针，推进大脑神经递质系统功能的研究。 

专家点评

王佐仁（中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心副主任，神经科学国家重点实验室副主任）

北京大学李毓龙教授领导的研究团队近日在Nature Methods上报道的新型多巴胺探针是神经调质研究领域的重大进展。他们研发的系列新型多巴胺探针都是基于蛋白质的荧光探针，可以通过基因操作将这些探针精准地表达到特异脑区和细胞集群中去，从而提供了准确的细胞类型特异性以及精准的亚细胞定位。这次他们研发的新一代多巴胺探针将检测信号的灵敏度提高了数倍，为实时在体检测多巴胺信号提供了前所未有的时间、空间分辨率。更重要的是：他们这次巧妙地将多巴胺荧光探针的发射波长设置在了红色区域，这一创造性的设计使得同时光学观测神经元活性（最常见的是通过GCaMP与内钙结合产生的GFP荧光变化反应神经元活性）与调质作用（如多巴胺释放）成为可能。这一新技术必将极大地推动神经科学领域的向前发展。 

近年来，李毓龙团队在新型神经递质（调质）检测探针研究领域取得一系列原创性的重大突破，为光学成像解析神经环路结构功能的研究提供了最新武器，帮助神经科学相关领域进一步拓展了研究的深度和广度。更重要的是：他们取得的这些成果结束了以往中国神经科学家只能用国外研发的技术的历史，标志着我国科学家在新技术原创开发能力上达到了一个崭新的高度。

专家点评

Naoshige Uchida（哈佛大学教授）

Dopamine is a very important neurotransmitter in the brain. However, until recently monitoring the activity of dopamine neurons has been difficult and this hampered our understanding of how dopamine functions in the brain. The genetically-encoded dopamine sensors developed by the Yulong Li lab and others have really revolutionized the way we study dopamine in the brain. The use of these sensors allows us to monitor the dynamics of dopamine in very natural conditions. Importantly, these sensors can be applied to many different animal species with high chemical specificity and large signals. These sensors also allowed us to monitor the activity of dopamine neurons in a projection specific manner. The newly developed red sensors now allow us to monitor multiple colors as well. We have already used these sensors in our lab, and they led to new discoveries. We greatly appreciate the generosity of Dr. Li for openly sharing these sensors. The robustness of these sensors will facilitate our understanding of dopamine during behavior.

多巴胺是大脑中一种非常重要的神经递质。然而，实时检测多巴胺神经元活性的困难很大程度上限制了人们对多巴胺功能的探索。近来，由李毓龙实验室等研究团队开发的基因编码的多巴胺探针为我们深入研究多巴胺带来了技术革新。这些探针使我们可以在自然生理条件下检测多巴胺的动态变化，可被应用于多种模式生物，且具有非常高的分子特异性和荧光响应幅度。此外，这些探针可以让我们检测具有特定投射模式的多巴胺神经元的活性。而最新开发的红色荧光多巴胺探针还让我们可以进行多色检测。我们实验室已经将这些探针应用于研究中并有了全新的科学发现。我们非常感谢李毓龙博士慷慨地在文章发表前就与我们分享这些精准的探针，帮助我们更好地理解多巴胺在动物行为中的功能。

参考文献

1. Sun, F. et al. A genetically encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice. Cell 174, 481–496.e9 (2018).

2. Tanaka, M., Sun, F., Li, Y. & Mooney, R. A mesocortical dopamine circuit enables the cultural transmission of vocal behaviour. Nature 563, 117–120 (2018).

3. Zhou, M. et al. Suppression of GABAergic neurons through D2-like receptor secures efficient conditioning in Drosophila aversive olfactory learning. Proc. Natl Acad. Sci. USA 116, 5118–5125 (2019).

4. Handler, A. et al. Distinct dopamine receptor pathways underlie the temporal sensitivity of associative learning. Cell 178, 60–75.e19 (2019).

5. Jing, M. et al. A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies. Nat. Biotechnol. 36, 726–737 (2018).

6. Jing, M. et al. An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity. Nature Methods (2020): 1-8.

7. Feng, J. et al. A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specific in vivo detection of norepinephrine. Neuron 102, 745–761.e8 (2019).

8. Peng, W. et al. Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons. Science 369.6508 (2020).

9. Wan, J. et al. A genetically encoded GRAB sensor for measuring serotonin dynamics in vivo. bioRxiv (2020).

10. Dong, A. et al. A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved endocannabinoid dynamics in vitro and in vivo. bioRxiv (2020).

11. Patriarchi, T. et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors. Science 360, 6396 (2018).

12. Patriarchi, T. et al. An expanded palette of dopamine sensors for multiplex imaging in vivo. Nature Methods (2020): 1-9.