人源V-ATPase高分辨率结构

来源：BioArt

作为一种重要的细胞器 ，溶酶体是细胞内由单层磷脂膜包被的酸性囊泡。溶酶体内含有60多种酸性水解酶，溶酶体的酸性环境对于这些水解酶的功能至关重要。溶酶体的水解酶可以降解各类生物大分子，如蛋白质、核酸、多糖以及各类脂质分子等，也能分解细胞器。因此，溶酶体是细胞内重要的物质回收站，对细胞生理代谢至关重要。如果溶酶体出现问题的话，我们就有可能罹患代谢病，最常见的例子是溶酶体贮积症【1】。统计表明，每1万个新生儿就有5例罹患此病，是比例最高的遗传性代谢病【1】。

近年来的研究发现，除了作为细胞内物质回收站，溶酶体也是细胞内重要的信号转导枢纽【2】。溶酶体的膜上分布着多种多样的离子通道、分子马达、以及信号蛋白，这些蛋白能够维持溶酶体内离子的稳态，保持溶酶体的酸性环境，同时也能起到传递信号的作用。因此，研究这些蛋白的分子结构和作用机理不仅有助于我们理解溶酶体的生理功能，还能为相关疾病的治疗提供思路。

长久以来，傅天民博士和王隆飞博士就对溶酶体以及溶酶体介导的信号转导机制感兴趣。在哈佛大学教授、美国科学院吴皓院士的强力支持下，他们在相关领域开展了一系列研究，取得了不错的进展。其中，他们对阳离子通道TRPM2的研究发表于2018年的Science杂志上【3】。

2020年10月15日，傅天民博士、王隆飞博士和吴皓院士在Molecular Cell上发表了文章Structures of a Complete Human V-ATPase Reveal Mechanisms of Its Assembly，解析了人源V-ATPase高分辨率结构【4】。

如前文所述，溶酶体内的酸性环境对于溶酶体正常行使功能至为重要，而V-ATPase就是负责把质子从细胞质转运到溶酶体的分子马达，因此，V-ATPase对溶酶体的重要性是不言而喻的。除此之外，V-ATPase还在多个人类重要生理过程中发挥着关键作用，比如免疫反应、神经信号传递、癌细胞转移、以及精子的成熟等【5】。V-ATPase是一个大的蛋白质复合物，存在于所有的真核生物中。

在酵母中，V-ATPase有31个亚基组成，而在哺乳动物中则包含了32个蛋白亚基。由于遗传操作和生化纯化的简便性，酵母长期以来一直是研究V-ATPase结构和功能的模式生物。酵母V-ATPase中等分辨率的冷冻电镜结构2015年发表于自然杂志，揭示了V-ATPase的基本结构框架【6】。V-ATPase整体结构呈哑铃形，包含一个称之为V1的复合物和一个Vo的复合物。

其中，V1复合物在细胞质内，能够结合并水解ATP，为V-ATPase转运质子提供能量；而Vo复合物则是包埋在溶酶体的膜内，负责把质子从细胞质内转运到溶酶体内。虽然酵母的V-ATPase结构生物学研究为我们理解V-ATPase的分子机理提供了框架，但是由于分辨率不高，V-ATPase的分子机理还有很多问题有待解答。另外，哺乳动物的V-ATPase比酵母的更为复杂。因此，他们决定利用生物化学和冷冻电镜手段对人类的V-ATPase进行研究，为全面理解人类V-ATPase的作用机理提供证据。

结构生物学研究的第一步是能够通过生化手段，制备出高质量的蛋白复合物。人类的V-ATPase亚基众多，不容易通过重组表达方式进行样品制备；而细胞内源性V-ATPase表达量很低，同时没有纯化标签，为样品制备工作带来了巨大挑战。2010年，普渡大学罗招庆教授课题组发现肺炎军团菌感染细胞时，会分泌一个叫做SidK的蛋白来抑制V-ATPase的活性【7】。

傅天民和王隆飞巧妙利用了这一发现，用一个加了Flag标签的Sidk蛋白作为诱饵，从培养的人293胚肾细胞内顺利纯化出了人类V-ATPase并解析了这个分子机器的冷冻电镜结构。他们捕捉到了人类V-ATPase三个不同构象的高分辨率结构，揭示了V-ATPase的分子结构和质子传递机理。V1通过水解ATP驱动Vo转动，进而把质子从Vo的细胞质区域转移到Vo靠近溶酶体的那一侧，实现了质子从细胞质逆浓度梯度转移到溶酶体的过程。

如同酵母的V-ATPase，人类的V-ATPase状若哑铃，包含一个V1复合物和一个Vo复合物（图A）。人类V-ATPase结构显示三个SidK蛋白分子结合到V1复合物上 (图A)，抑制了V1水解ATP的活性，从而抑制了V-ATPase的功能。Vo复合物中，亚基c和c”形成了一个空心圆柱体，我们称之为c-Ring，在c-Ring的里面有两个辅助亚基ATP6AP1和ATP6AP2，在c-Ring的侧面蛋白亚基a、e和RNAseK组成了一个三元复合物，紧紧贴在c-Ring上 (图B)。蛋白亚基a和c-Ring是实现质子传递的关键成分。

值得一提的是，高分辨率的Vo复合物结构揭示了很多新的信息，总结如下：

第1、人类的Vo复合物中存在三个糖脂分子。其中，结构分析和质谱分析显示，两个糖脂分子是神经节苷脂，第三个糖脂分子是多萜醇磷酸多糖苷（Dol-pp-Glycan）(图B)。多萜醇磷酸多糖苷广泛存在于内质网上，是蛋白质N糖基化的前体物。人类的V-ATPase是在内质网上进行组装的，因此，多萜醇磷酸多糖苷应该是在V-ATPase组装过程中整合到蛋白亚基上，跟亚基a，e以及c-Ring形成了绵密的相互作用网。有趣的是，这个糖脂分子的密度在酵母的V-ATPase中也曾经被观察到，由于酵母V-ATPase结构分辨率不够高，没有能够鉴定出这个分子的身份【8】。此外，在我们文章投稿和复审过程中，来源于大鼠和牛脑的V-ATPase结构也先后发表，这两个结构也同样观察到了多萜醇磷酸多糖苷的密度，同样因为分辨率问题，被误认为是一个蛋白质多肽【9,10】。综合多方面的研究，多萜醇磷酸多糖苷很可能是真核生物V-ATPase的一个关键组成成分，在V-ATPase的合成、组装、转运，甚至正常行使功能都发挥着重要作用，该发现为下一步的研究打开了大门。

第2、人类的Vo复合物存在多个糖基化修饰位点，Vo结构中发现了8个糖基化位点(图C)。其中6个糖基化位点在辅助亚基ATP6AP1上，1个在亚基a上，一个在亚基e上。序列比对发现，这些糖基化位点在脊椎动物中高度保守，暗示了其功能的重要性。遗传学研究也表明，糖基化位点的突变会影响V-ATPase的定位和组装。此外，结构分析发现，这几个糖基化位点上的多糖链和Vo上的糖脂分子形成了一层厚厚的糖衣 (图C)，包裹在Vo在溶酶体一侧的蛋白亚基表面，可能起到保护蛋白稳定性的作用。

第3、人类Vo复合物上结合了29个脂质分子。其中，5个结合在蛋白亚基a、e和RNAseK上，24个在c-Ring内部形成了两层脂质分子层 (图B & D)。质谱分析表明，这些脂质分子有磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）以及胆固醇，其中磷脂酰胆碱的含量最高。这些脂质分子与蛋白质亚基形成了密切的相互作用，可能在V-ATPase的组装以及质子传递中起到重要作用。

第4、该研究还发现ATP6AP1与多个蛋白质亚基以及脂质分子形成了密切的相互作用 (图D)，很像一个结构枢纽，可能在V-ATPase组装中起到招募其他亚基的功能。此外，与酵母不同的是，人类的ATP6AP1有一个N端结构域，位于溶酶体内。研究发现，这个结构域像一个三角锥，全部由贝塔片层组成 (图D)。结构比对发现，这个结构域跟溶酶体表面名为LAMP的蛋白家族成员非常相似。目前，我们对这个结构域的具体功能了解不多，鉴于它与LAMP成员结构的相似性，它们功能上可能存在一定的相关性。

综上所言，该研究表明V-ATPase实质上是一个蛋白质、脂分子和糖基的复合物，这些脂分子、糖脂分子以及糖基对V-ATPase的生成、组装、转运、以及行使功能都是不可或缺的。该研究为下一步继续研究V-ATPase的生成、组装以及分子机理打开了大门。

该研究中的质谱工作由牛津大学Carol Robinson教授课题组的博士后研究员Wu Di博士完成。傅天民博士已于今年夏天在俄亥俄州立大学建立自己的实验室，将继续在溶酶体信号转导领域开疆拓土，诚挚欢迎各位青年才俊加盟。