邢毅团队利用深度学习强化RNA可变剪接分析的准确性

来源：未来论坛

YOSIA Webinar 「AI+科学」系列 "AI+基因科学”主题将于10月17日上午在线举办。本文转载本期活动主讲嘉宾之一，宾夕法尼亚大学医学院病理学与实验医学系邢毅教授课题组的科研成果，作为活动内容解读。

点评丨张强锋（清华大学生命科学学院教授）、马坚（美国卡耐基梅隆大学计算机学院教授）

真核生物的基因区别于原核生物的一个重要特征是具有内含子，内含子的存在，使得真核基因的表达必须经过RNA剪接这一重要步骤。高等真核生物的一个基因中含有多个内含子。通过对RNA剪接的调控，使得一个基因能够转录出多个不同的转录本，从而编码多个蛋白质，增加了生命体的复杂度和适应度【1】。

剪接反应由剪接体催化完成，剪接体含有170多个相关蛋白，具有高度的复杂性与动态性【2】。虽然通过冷冻电镜技术已经获得了多个酵母及人的剪接体反应中间状态的结构【3】，但是以目前对剪接反应机制的了解，仍然不能根据序列等条件不经过实验而直接较为准确的推断RNA可变剪接的结果。对RNA剪接的研究，还是需要通过实验手段进行，最常用的便是RNA-seq技术。

RNA-seq技术虽然能较好的定量基因表达的结果，但是对于差异剪接分析来说，它需要更高的测序深度。即便如此，现有的计算方法仍然不能较为准确的定量低表达基因的剪接变化。因此，为了提高剪接定量的准确性，急需引入新的计算分析方法。

2019年3月25日，来自宾夕法尼亚大学/费城儿童医院的邢毅教授团队在Nature Methods上发表了题为Deep-learning augmented RNA-seq analysis of transcript splicing的工作，首次将深度学习与贝叶斯假设检验结合，用于RNA可变剪接分析。该文章提出了一种新的计算框架（DARTS，Deep-learning Augmented RNA-seq analysis of Transcript Splicing），通过对公共数据库中大量RNA-seq结果的深度学习，即使对于那些测序深度不那么高的样品，也能够有效提高RNA-seq定量差异剪接的准确度。

DARTS由两部分构成：深度神经网络模块（DNN）和贝叶斯推断模块（BHT）。DNN基于顺式序列特征和样品特异的RNA结合蛋白表达水平特征来预测差异剪接的结果；BHT通过整合实验样品测序数据本身和基于深度神经网络的先验概率来推断差异剪接的结果（图1）。

图1. DARTS的基本框架

与别的计算方法不同，DARTS DNN不仅通过顺式序列特征来预测可变剪接的结果，而且还将样品中RNA结合蛋白的表达水平整合进了RNA可变剪接结果的预测中，增加了预测参数的维度（图2）。

图2. DARTS DNN的特征

通过DNN对ENCODE 和Roadmap数据库中大量RNA-seq结果的深度学习，能够获得高精度的预测值作为BHT中的贝叶斯先验概率，进而结合具体实验中RNA-seq的结果，获得更为准确的差异剪接推断。研究者发现，在低通量RNA-seq文库中，通过使用DNN预测值进行强化分析后，能够达到比使用传统方法分析更高的准确度，并且这种提升在越低通量的文库中越发明显。即使在高通量的RNA-seq文库中，使用DNN预测仍能发现在低表达基因中的可变剪接变化。而在过去，这些低表达基因的可变剪接变化在传统分析方法中会被忽略。DARTS不仅提升了基于RNA-seq方法研究可变剪接的准确性，同时也提供了在低表达基因中研究可变剪接的研究手段。

张强锋（清华大学生命科学学院教授）

可变剪接现象从70年代发现后，其基本的科学问题聚焦为可变剪接位点发现、差异分析、调控元件和网络的发现和构建。RNA-seq 技术的发明，使得系统、定量的可变剪接差异分析成为可能。大量测序数据的可变剪接差异分析需要优秀的统计模型和计算工具，因此一直是一个需要高度技巧的生物信息学研究课题。宾夕法尼亚大学/费城儿童医院的邢毅教授研究组在此领域深耕多年，贡献了多个有影响力的算法和计算工具。邢毅教授最先提出了用“剪接图”（splicing graph）的数据结构和概率算法来推导和定量转录组的mRNA异构体【4,5】，这些算法在转录组分析领域产生了深刻的影响，已经成为高通量RNA测序数据分析的算法基础。针对高通量RNA-seq数据，邢毅教授研究组开发出的用于差异剪接分析的rMATS软件【6】，已经在全世界被下载超过25,000次，被广泛用于转录组的数据分析。再加上别的研究组开发的例如MISO、SpliceTrap、MAJIQ、SUPPA等软件，虽然各有特点，但对于测序较深、质量较好的数据集都能取得不错的结果。然而，有大量RNA-seq 测序实验在设计时，由于成本等原因，测序深度较浅。对于这些数据集，能利用来做差异分析的可变剪接事件非常有限。

在方法上，DARTS最大的特色是巧妙利用了公开的RNA-seq大数据样本，使用深度神经网络学习得到了外显子差异剪接的贝叶斯假设检验统计模型的准确先验概率分布。另外独立来看，使用深度神经网络通过顺式序列和反式因子RBP表达丰度进行差异剪接预测的思路也值得借鉴。总的来说，DARTS综合了深度学习和贝叶斯假设检验统计模型的优点，为那些低测序深度的数据提供了更好的做可变剪接的分析的手段，拓展了传统RNA-seq可变剪接分析的敏感度和准确度。

马坚（美国卡耐基梅隆大学计算机学院教授）

近些年来深度学习的应用席卷各行各业。在系统生物学领域，尤其是基因组学，由于其海量数据的积累，加上众多奇妙而未知的生物学问题，研究人员对深度学习的使用同样变得如火如荼。但是如何可靠有效的利用深度学习去体现基因组海量数据的潜在优势，并且真正发现新的生物学知识是基因组学和计算生物学最有意义的挑战之一。

邢毅教授实验室的这个DARTS工作清新优雅不落俗套，在目前众多深度学习在基因组学的应用中明显脱颖而出。从计算方法设计的策略和概念角度而言，此工作的最大的亮点是充分利用海量公有数据如ENCODE，但模型本身又不完全依赖于这些公有数据。也就是说，有效综合了海量数据的训练以及新样本的特殊性。DARTS的整体思想是用深度神经网络从现有海量数据中找出通用的有用信息作为先验，然后用贝叶斯假设检验结合来自样本本身的RNA-seq数据信息做可变剪接的预测。在基因组学中，确实有很多类似的问题 -- 如何在现有数据（已有细胞系）上对特定的基因组标注（譬如染色质结构、转录因子结合）训练一个机器学习模型并在完全新的细胞系中有效预测，已经成为一个计算基因组学中广泛关注的问题。因此，DARTS崭新的整体设计理念值得很多其他类似的问题借鉴。

从模型本身的技术角度而言，DARTS有效利用了深度神经网络对异质数据特征的整合，并且整个计算方法的评测和方法比较都明智而审慎。譬如，DARTS的深度神经网络部分结合了剪接位置附近的序列信息、进化信息、可变剪接产生的RNA二级结构信息、RBP的表达信息等。DARTS巧妙的利用深度神经网络预测的结果来作为贝叶斯假设检验中先验，结合样本本身的RNA-seq序列信息实现了更可靠的可变剪接预测。文中其他对于机器学习方法的评测同样可圈可点。例如，常见的对正负样本不均衡的问题对模型训练和评测带来可能的偏差有细致入微的控制。另外，对模型中每个模块的贡献也做了详细分析。随着RNA-seq数据的不断积累，相信DARTS会有广泛的应用，尤其是在RNA-seq测序深度并不高的实验情况下。这个计算工具对进一步理解可变剪接在不同细胞状态下的调控机理将有深远的意义。

常有人说众多深度学习的基因组学应用并没有带来太多惊喜，是 "a blind man in a dark room looking for a black hat which isn t there"。在基因组学这个存在太多未知和容易迷失的领域，有效深度学习的使用需要有强大的领域知识作为支撑。DARTS工作体现了邢毅教授实验室多年以来对可变剪接机理的研究和计算方法创新的积累，由深入的领域知识和经验作为指导，是一个有效利用不同计算模型和深度学习方法的优势实现基因组学新发现的经典工作。

参考文献

1. Baralle, F. E. & Giudice, J. Alternative splicing as a regulator of development and tissue identity. Nature Reviews Molecular Cell Biology .18, 437-451. (2017).

2. Wahl, M. C., Will, C. L. & Luhrmann, R. The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell 136, 701-718. (2009).

3. Shi, Y. Mechanistic insights into precursor messenger RNA splicing by the spliceosome. Nature Reviews Molecular Cell Biology .18, 655-670. (2017).

4. Xing, Y., Resch, A., Lee, C. The multiassembly problem: reconstructing multiple transcript isoforms from EST fragment mixtures. Genome Research. 14(3):426-41. (2004).

5. Xing, Y., Yu, T., Wu, YN., Roy, M., Kim, J., Lee, C. An expectation-maximization algorithm for probabilistic reconstructions of full-length isoforms from splice graphs. Nucleic Acids Research. 34(10):3150-60. (2006). 

6. Shen, S., Park, JW., Lu, ZX., Lin, L., Henry, MD., Wu, YN., Zhou, Q., Xing, Y. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111(51):E5593-601. (2014).