Nat Biotech：突破瓶颈，共表达两个基因可增加植物再生效率

来源：iPlants

通过基因组编辑改善作物农艺性能的前景巨大，但是通常会受到植物再生效率低和可转化基因型很少限制。2020年10月13日，Nature Biotechnology杂志在线发表了来自美国加利福尼亚大学戴维斯分校Jorge Dubcovsky课题组题为“A GRF–GIF chimeric protein improves the regeneration efficiency of transgenic plants”的研究论文。该研究表明编码由GRF转录因子及其GIF辅因子组成的嵌合体的序列的表达大大提高了单子叶和双子叶物种的再生效率，增加了可转化品种的数量，并产生了可育的转基因植物。

GRF转录因子(GRFs)是一类植物特有的转录因子家族，编码含有QLQ和WRC结构域的蛋白，其分别介导蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用，在被子植物、裸子植物和苔藓中高度保守。GRFs信号通路介导植物种子发育,根系生长,花的发育等很多重要的生命过程。GRF相互作用因子（GIFs）能与GRFs形成复合体起作用，其突变表型类似过表达的miR396植株，表现植物器官大小的减小，而过表达GIF基因表现为促进器官生长并且可以提高的GRF的活性。此外，在拟南芥中同时表达GRF3和GIF1可增加促进生长更大的叶片尺寸，比表达单个基因要大。

该研究将小麦中的GRF4和GIF1产生一个GRF4-GIF1嵌合体，并由玉米UBIQUITIN启动子过表达。研究发现过表达GRF4-GIF1嵌合体的转基因植物可育并表现出正常的表型。进一步在四倍体小麦Kronos中进行了18次转化实验，并估计了再生频率。研究表明GRF4-GIF1嵌合体的平均再生效率（65.1％±5.0％）比空白载体对照（8.3％±1.9％，P  <0.001 ）高7.8倍（见下图）。但是如果单独表达单个基因或在同一构建体中分别表达两个基因的再生效率，也都达不到GRF4-GIF1嵌合体的水平，说明两种蛋白质的强制接近增加了其诱导再生的能力。

之后，该研究还测试了GRF4–GIF1嵌合体对以往再生效率低的品种，如商业硬粒小麦，面包小麦和黑小麦产生转基因植物的潜力。研究表明在不同条件和方案下添加GRF4-GIF1嵌合体可有效提高其他小麦的再生效率。此外，该研究还测试了小麦GRF4-GIF1嵌合体对水稻的再生效率，研究表明用小麦GRF4–GIF1嵌合体转化水稻品种Kitaake的愈伤组织的再生效率也提高了2.1倍。综上所述，小麦GRF4-GIF1嵌合体可有效增强单子叶植物物种的再生。

另一方面，该研究还观察到用GRF4-GIF1嵌合体的农杆菌接种Kronos和Fielder胚胎后，在没有细胞分裂素的生长素培养基中也能快速再生绿芽（见下图）。此外，使用不含抗性标记的GRF4–GIF1的载体也可在只含生长素培养基中选择到阳性转基因芽。因此，高表达无选择标记的GRF4-GIF1嵌合体的转基因植物有可能用于未来的转化实验中，以便其作为母体进行其他基因的转化。

之后，该研究将GRF4-GIF1嵌合体和Cas9和-sgRNA构建在同一个载体上进行农杆菌转化，研究表明在32个转化的愈伤组织中有30个阳性转基因，并且在所有30个阳性转基因苗中都被基因编辑了，效率达到93.7%（见下图）。

最后，该研究还在柑橘进行了类似的GRF–GIF载体构建，研究表明嵌合体显示出再生效率增加了4.7倍。并且构建对miR396有抗性的葡萄GRF-GIF嵌合体，研究发现rGRF–GIF嵌合体再生最高频率与对照相比增加7.4倍，说明了GRF–GIF技术在双子叶植物中提高再生效率也有效果。

综上所述，GRF4-GIF1嵌合体的表达显着提高了小麦再生的效率和速度。嵌合体的表达还扩展了可转化基因型的范围，并消除了细胞分裂素再生的需要，从而消除了对基于抗生素的选择标记的需求，因此该技术可以扩展到再生效率低的其他农作物，解决当前由于再生效率低，而无法进行基因编辑的瓶颈！