Nature：正常结直肠上皮细胞体细胞突变图谱

来源：BioArt

通过对多种类型的癌症细胞进行基因组测序，目前已经鉴定出癌症驱动基因的突变库，并揭示了产生体细胞突变的潜在生物过程的突变特征。但是，癌症是细胞进化选择后的最终结果，通常由几个驱动基因的突变累积，导致一系列克隆扩张形成。目前，大多数类型的癌症包括结直肠癌，从正常的细胞进展到癌症最早期的机制尚不清楚。驱动基因的突变可能开启结直肠上皮细胞的癌变之路，但导致其突变的过程在正常细胞中也存在；具有驱动基因突变的最早期肿瘤克隆在形态学上与正常细胞是无法区分的，我们对最早期肿瘤克隆的性质和数量缺乏深入研究。通过揭示小肠、大肠、肝、血液、皮肤和神经系统中常见体细胞突变过程的特征，发现正常的皮肤、食道和子宫内膜上皮细胞中含有携带驱动基因突变的克隆【1】，而且在血液中检测出大量的突变克隆【2】。然而，在癌症高发部位——结肠中缺乏相关的研究。

结肠上皮是连续的细胞片层，由～1500万个隐窝结构组织而成，每个隐窝由～2000个细胞构成。在隐窝底部存在少量干细胞，是隐窝成熟和分化细胞的来源。这些干细胞通过中性漂移（neutral drift）的过程随机进行替换【3】，使得一个隐窝中的所有细胞都来源于单个干祖细胞。因此，干祖细胞的体细胞突变在约2000个后代细胞都存在，可以通过对单个隐窝进行DNA测序得到。而这些干细胞被认为可能是结直肠癌细胞的起源。隐窝成为研究结直肠癌从正常细胞进展到癌症最早期机制的理想研究系统。 

2019年10月24日，来自英国Wellcome Sanger Institute的Michael R. Stratton在Nature杂志发表文章，The landscape of somatic mutation in normalcolorectal epithelial cells，通过对42名参与者的2035个结肠隐窝进行全基因组测序，揭示了多个突变过程的特征；一些具有普遍性和延续性，另一些则只在某些个体、某些隐窝或者生命中的特定时期出现。此外，中年人中约有1%的正常结直肠隐窝携带驱动基因突变，表明形态正常的大肠上皮携带肿瘤突变是普遍发生的，但腺瘤和癌的发生是罕见的；与正常细胞相比，结直肠癌细胞的突变负担显著增加。

研究人员利用激光捕获显微切割技术从42名11至78岁参与者的正常上皮细胞中分离出2035个单个结肠隐窝，其中15名有结直肠癌病史，27名无结直肠癌病史，并对隐窝进行全基因组测序。571个隐窝全基因组测序的变异等位基因片段分析表明隐窝中全部细胞来源于同一个祖干细胞，而且约90%的突变被克隆继承。个体间隐窝的突变负荷差异较大，如60多岁的个体其突变负荷在1508～15329之间。对突变特征进行分析，发现9个单碱基替换（SBS）、6个双碱基替换（DBS）、5个小片段插入删除突变（indel）；其中14个与已知的参考特征非常匹配，6个为全新的特征。

SBS1、SBS5、SBS18、DBS2、DBS4、DBS6、DBS9、DBS11、ID1、ID2、ID5等11个特征因在超过85%的隐窝中存在，被命名为普遍性突变特征。其中SBS1是NCG三碱基中C>T的替换，可能是5-甲基胞嘧啶脱氢酶作用的结果。其突变负荷与年龄呈现线性相关，但在个体内部的隐窝间存在差异。SBS1的突变速率在结肠的不同部位呈现差异，升结肠和盲肠每年有16.8个突变，横结肠为16.1个，降结肠和乙状结肠为12.8个，回肠末端为12.7个。其余的普遍性突变特征都呈现出与年龄的相关性，表明在所有个体、所有结肠干细胞中，突变过程贯穿整个生命周期；但生理状态、微环境等影响体细胞突变速率。SBS2、SBS13、SBSA、SBSB、SBSC、SBSD、DBS8、IDA、IDB等9个特征仅仅在部分个人、部分隐窝中出现，被命名为偶发性突变特征，而且除了SBS2、SBS13、DBS8其他均为新型特征。SBS2和SBS13是TCN中C>T、C>G的突变，可能由APOBEC家族的胞苷脱氢酶引起，通常同时出现；SBS2和SBS13同时出现在2个不同参与者的隐窝中，每个导致超过150个突变。这是首次在正常细胞中检测到APOBEC胞苷脱氢酶对人类基因组的DNA编辑现象。SBSA突变特征在29个参与者中检测到，导致部分隐窝中上千个突变。为了研究SBSA的发生时间，研究人员构建突变的系统发生树，并定位了每个分支的突变特征，结果显示SBSA属于系统发生的早期分支，在个体到达10岁之间就处于活跃的状态。SBSA可能是由于儿童期发生的外源性、局部作用的、不均匀分布的突变性损伤导致。SBSB在10岁前最为活跃，SBSB和DBS8、IDB相关，其突变过程具有类似性。其中一位66岁参与者的所有隐窝中都携带上千个SBSD突变，这可能与其接受过多次化疗有关，这是首次在正常人类细胞中观察到化疗导致的突变结果。该参与者的结直肠上皮的突变负荷比其年龄预期的要高3-5倍。

驱动基因突变在癌症进化过程中能够建立选择优势。综合分析571个隐窝的全基因组序列和靶向90个已知的结直肠癌基因对其余隐窝进行测序，发现1403个隐窝发生驱动基因的替换突变，1046个发生indels；并且隐性癌基因AXIN2和STAG2显示促进出阳性选择，很可能是癌症驱动因素。其他可能的癌症驱动因素是具有典型错义突变的癌症基因，包括PIK3CA、ERBB2、ERBB3、FBXW7等。一位50-60岁的参与者有1%的正常结直肠隐窝携带驱动突变，但约有40%的70岁以上的老人经过结肠镜确诊为腺癌，5%的人会罹患结直肠癌，这表明仅有极其少部分的隐窝微瘤会在接下来的几十年里发展成腺瘤或癌变。

对比正常结直肠干细胞和结直肠癌细胞的基因组，发现结直肠癌细胞中共有10000-20000个替换突变，1000-2000个indels；而50-60岁参与者的正常隐窝中约有3000个替换突变，300个indels，突变负荷远远低于结直肠癌细胞。偶发性突变和普遍性突变在结直肠癌患者和无癌参与者的隐窝间没有差异，如果正常细胞中突变过程的差异决定人们是否罹患结肠癌，那么这些突变过程应该只影响结肠中极少部分的隐窝，或者对突变的速率仅有微弱的作用，无法被检测到。此外，癌症基因突变的相对频率在结直肠腺瘤、结直肠癌和正常大肠细胞不同。例如，结直肠癌中APC、KRAS、TP53的突变非常普遍，占56%的碱基替换和indel驱动基因的突变，但在携带突变的正常隐窝中非常稀少；而ERBB2、ERBB3在驱动突变的正常隐窝中非常普遍，但在结直肠癌细胞中少见。而且，驱动突变的频率在结直肠癌患者和无癌参与者的隐窝间没有差异。

总的来说，研究对正常的结直肠细胞进行基因组测序分析，定量地对癌症细胞形成过程的的基因组和克隆进化过程进行深入研究，揭示出正常结直肠细胞的突变特征，并表明突变的发生是普遍的，但癌症的形成过程具有罕见性，为我们理解癌症的最早期形成提供了新的视角。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1672-7

参考文献

1. Martincorena, I. et al. High burden and pervasivepositive selection of somatic mutations in normal human skin. Science 348,880–886 (2015).

2. Genovese, G. etal. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNAsequence. N. Engl. J. Med. 371, 2477–2487 (2014).

3. Snippert, H. J.et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition betweensymmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell 143, 134–144 (2010).