Nature ： 分枝杆菌VII型分泌系统的结构

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致病性分枝杆菌有多达5个同源的ESX/VII型分泌系统（T7SS），其中ESX-1、ESX-3、ESX-5介导了结核病中发挥特定作用的效应蛋白的分泌。ESX-3在铁限制时被诱导表达，参与金属稳态、抑制CD4+ T细胞的活化、吞噬体成熟和病原体诱导的吞噬损伤修复有关【1】。ESX分泌系统有5个保守的核心膜组分，分别是EccB、EccC、EccD、EccE、MycP，介导EsxA:EsxB毒性因子家族和DNA的分泌。关于ESX-5的生化和结构研究表明，EccB、EccC、EccD、EccE等四个组分在细胞外膜上聚集形成稳定的六聚体分泌孔【2】，而MycP是膜锚定蛋白酶，与稳定的分泌孔没有紧密的联系。耦联蛋白EccC识别细胞质中效应蛋白，并为其运输提供能量【3】。

近期的研究解析了结核杆菌T7SS的部分结构，获得了EccB、EccC、EccD可溶结构域的晶体结构。ESX-5的低分辨率负染色电镜结构显示，T7SS组装形成六聚体，但染色剂的使用限制了分析复合物内部结构信息的可能性。所以，如何获得一个高分辨率的T7SS还需要进一步研究。

2019年10月10日，来自西班牙的Oscar Llorca和来自德国的Sebastian Geibel合作在Nature杂志发表文章Architecture of the mycobacterial type VII secretion system，报道了分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）中ESX-3/VII型分泌系统的膜包埋核心复合物的冷冻电镜结构，分辨率达到3.7Å。ESX-3分泌机器的核心由EccB3、EccC3、EccD3、EccE3以1:1:2:1的比例组成，构建了两个相同的原聚体。EccC3耦连蛋白包含了四个ATPase结构域组成的灵活性阵列，通过stalk结构域与膜相连。未知结构域（domain of unknown function，DUF）邻近stalk，被鉴定为ATPase结构域，对分泌是必需的。EccB3主要位于周质，但有一小段跨过膜与stalk结构域相连，表明底物通过与EccC3远端相结合及随后的DUF中ATP的水解引发stalk结构域的构象变化，进而导致底物分泌到周质中。

研究人员首先鉴定出ESX-3的核心组分EccB3、EccC3、EccD3、EccE3四个膜组分，然后构建了最小表达体系对ESX-3核心复合物进行纯化。核心复合物约为～900kDa，2D class显示出一个中心突出的密度和一个跨膜区域的形状。膜的另一侧即“叉”和“臂”，具有柔韧性。“叉”的区域是刚性的，但柔韧地附着在膜上。进一步解析得到分辨率为3.8Å的冷冻电镜结构信息，显示两个相似的原聚体相互作用形成二聚体结构。综合电镜结构信息和交联质谱分析，EccD3的小亲水域和EccC3、EccE3相连，但不与EccB3相连，所以EccC3、EccD3、EccE3的可溶性结构域组成细胞质内的“臂”结构，而EccB3的可溶性结构域形成膜层对侧的“叉”结构。密度分析显示EccB3的周质结构域连接到其跨膜螺旋（trans-membrane helices，TMH）上，将其锚定在膜上。每个原聚体包含25个跨膜螺旋，其中2个EccD3有2*11个，EccB3有1个，EccE3有3个。2个EccD3反向平行相互作用形成支架，膜上的EccD3通过TMH和EccB3或EccE3作用，EccD3的膜结构域通过TMH与自身的N端Ubl结构域相连；在细胞质中，Ubl结构域及其与膜结构域的链接形成支架，为EccB3、EccC3、EccE3的几个胞质结构域提供结合位点。两个N端TMH将EccC3插入到膜内，而EccC3通过stalk结构域将其胞质结构域连接到膜上。Stalk结构域邻近DUF结构域，DUF显示出ATPase折叠的构象。EccC3-DI ATPase结构域与DUF结构域相连。EccE3通过2个TMH和膜相连，与胞质的EccD3-Ubl结构域二聚体形成广泛的界面。总体而言，ESX-3核心复合物包含了2个相同的原聚体，每个原聚体由EccB3、EccC3、EccD3、EccE3以1:1:2:1的比例组成。EccB3二聚体的周质结构域连接到TMH，将两个原聚体锚定在一起。

研究人员通过功能实验验证其结构的正确性。通过向分泌缺陷的分枝杆菌中回补完整或突变的ESX-3基因簇，发现完整的ESX-3能够恢复分泌系统，但缺失EccB3的周质结构域，或缺失EccE3，或缺失EccC3的DIII结构域、或突变DUF等都导致分泌效应分子EsxG、EsxH的失败。

由于ESX-5形成六聚体结构，而ESX-3却是二聚体结构，所以研究人员进一步检测是够存在更大的寡聚体。结果显示，ESX-3能够在膜上形成更大的复合物，这或许在纯化过程中被破坏。但EccB3、EccC3、EccD3、EccE3以1:1:2:1的比例组成原聚体在分泌完整的细胞中得到验证。3个ESX-3二聚体能够形成六聚体，组成分泌孔；分泌物EsxG：EsxH二聚体的大小为22Å，而分泌孔大小～25Å，足够分泌物的通过。在分泌孔的胞质面，6个EccC3的耦连组分组成一个独特的前庭结构，由一个stalk结构域和4个EccC3的ATPase结构域（DUF、DI、DII、DIII）组成。Stalk结构域和EccB3的N端螺旋间的广泛连接显示，底物结合DIII结构域和随后DUF对ATP的水解能够导致构象变化，直接导致分泌孔的打开或关闭。

总的来说，该研究以高分辨率解析了分枝杆菌的ESX-3/VII型分泌系统的结构信息，揭示了分枝杆菌的新型分泌机制，为理解分枝杆菌的治病过程和治疗提供了新的视角。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1633-1

参考文献

1. Serafini, A., et al., Characterization of a Mycobacterium tuberculosis ESX-3 conditional mutant: essentiality and rescue by iron and zinc. J Bacteriol, 2009. 191(20): p. 6340-4.

2. Beckham, K.S., et al., Structure of the mycobacterial ESX-5 type VII secretion system membrane complex by single-particle analysis. Nat Microbiol, 2017. 2: p. 17047.

3. Rosenberg,O.S.,etal.,SubstratesControlMultimerizationandActivationofthe Multi-Domain ATPase Motor of Type VII Secretion. Cell, 2015. 161(3): p. 501-12