Nature：琥珀酸受体SUCNR1结构揭示其选择性拮抗剂的作用原理

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三羧酸循环的中间产物琥珀酸参与体内代谢过程，并在线粒体活性氧稳态平衡的维持中起重要作用【1】。SUCNR1（也称为GPR91）是琥珀酸信号传递的受体，它是G蛋白偶联受体家族的一员【2】，并将琥珀酸信号传递与肾素引起的高血压、视网膜血管生成以及炎症反应联系起来【3-5】。因为SUCNR1感受到琥珀酸信号是一种危险的免疫信号【6】，它预示着体内可能会有溃疡性结肠炎、肝纤维化【7】、糖尿病和类风湿性关节炎的发生【3,8】，但是，从另一方面来说，它也就成为了意义重大的潜在治疗靶点。

2019年10月24日，瑞士巴塞尔的诺华制药公司诺华生物医学研究所的研究人员，由Veli-Pekka Jaakola、 Klemens Kaupmann和Matthias Haffke带领的研究团队在Nature在线发表题为Structural basis of species-selective antagonist binding to the succinate receptor的研究论文，该研究解析了大鼠SUCNR1结合纳米体抗体复合物的高分辨率的晶体结构，此时SUCNR1处于非活性构象。随后进行了基于结构的突变和放射性配体研究，结合分子建模技术，确认了对物种选择性拮抗起作用的关键氨基酸残基。

研究人员首先对人和大鼠SUCNR1的同源基因进行筛选，以得到最优的表达、纯化的条件。同时他们还筛选了各种融合蛋白以及用于G蛋白偶联受体（GPCRs）的典型去垢剂。最后他们选定了来源于大鼠的SUCNR1，因为相比于人源的SUCNR1，它完全没有糖基化位点，同时在体外也更加稳定，有利于后续的结晶等实验的进行。

接着，研究人员又产生了相应的一些纳米抗体，用它们来稳定SUCNR1并捕获单一构象的分子。最后他们发现纳米抗体6能够和大鼠SUCNR1形成稳定的复合体并使它的热稳定性增强，并且在[35S]GTPγS实验中，纳米抗体6起着负变构调控因子的作用。因此，纳米抗体6很可能能把大鼠SUCNR1稳定在均一的非活性构象下。

至此，给研究蛋白质晶体结构的同鞋们造成最大阻挠的蛋白稳定性和均一性问题已经完美解决了，下一步理所应当的就是得到漂亮的晶体和高分辨率数据了。研究者们最终收集到了2.1 Å的衍射数据，并得到了非常高质量的电子密度图，顺利解析了大鼠SUCNR1和纳米抗体6的复合体的晶体结构。（见图1）

图1. 大鼠SUCNR1和纳米抗体6的复合体结构

基于前期发现拮抗剂NF-56-EJ40只能特异性结合人源SUCNR1，而几乎不结合大鼠的SUCNR1。研究人员通过分子建模得到了人SUCNR1的结构，并与NF-56-EJ40进行分子对接后，找到了两个NF-56-EJ40物种选择性相关的两个关键残基E22和N274。而大鼠SUCNR1中对应的氨基酸残基则是K18和K269，这两个关键氨基酸的差异导致NF-56-EJ40几乎不结合大鼠SUCNR1。因此，他们随后构建了人源化大鼠SUCNR1，即K18E/K269N双突变体，发现结果和推测的完全一致，NF-56-EJ40对人源化大鼠SUCNR1的结合能力几乎等同于对人SUCNR1的结合能力。

随后，研究人员又发现人源化大鼠SUCNR1与NF-56-EJ40拮抗剂结合之后，热稳定性大大增强，这使得他们顺利结晶并解析了人源化大鼠SUCNR1-纳米抗体6-NF-56-EJ40三分子复合体的高分辨率（约2 Å）晶体结构。

图2. 人源化大鼠SUCNR1与拮抗剂NF-56-EJ40结合模式图

研究人员将晶体结构与之前分子对接得到的人源SUCNR1与NF-56-EJ40相互作用模式图进行比较，发现差异还是比较显著的。这也从一个方面说明了晶体学方法解析蛋白质结构相对于同源建模、冷冻电镜等方法还是具有它本身无可取代的优势--更准确反应蛋白质构象以及更高的分辨率。这对于将蛋白分子用于药物筛选的靶点来说是非常关键的，差之毫厘，谬以千里!

文中解析的SUCNR1的晶体结构是水杨酸代谢物受体的第一个晶体结构，具有重要意义。同时结晶过程中使用纳米抗体6和拮抗剂NF-56-EJ40来稳定SUCNR1的构象等方法方面的尝试，也具有借鉴意义。该研究结果对于表征SUCNR1在代谢和免疫疾病中所起的作用也具有重要意义。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41586-019-1663-8

参考文献

1. Tretter, L., Patocs, A. & Chinopoulos, C. Succinate, an intermediate in metabolism, signal transduction, ROS, hypoxia, and tumorigenesis. Biochim. Biophys. Acta 1857, 1086–1101 (2016).

2. He, W. et al. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G-protein-coupled receptors. Nature 429, 188–193 (2004).

3. Gilissen, J., Jouret, F., Pirotte, B. & Hanson, J. Insight into SUCNR1 (GPR91) structure and function. Pharmacol. Ther. 159, 56–65 (2016).

4. Peruzzotti-Jametti, L. et al. Macrophage-derived extracellular succinate licenses neural stem cells to suppress chronic neuroinflammation. Cell Stem Cell 22, 355–368.e13 (2018).

5. Schneider, C. et al. A metabolite-triggered tuft cell-ILC2 circuit drives small intestinal remodeling. Cell 174, 271–284.e14 (2018).

6. Rubic, T. et al. Triggering the succinate receptor GPR91 on dendritic cells enhances immunity. Nat. Immunol. 9, 1261–1269 (2008).

7. Cho, E. H. Succinate as a regulator of hepatic stellate cells in liver fibrosis. Front. Endocrinol. 9, 455 (2018).

8. Littlewood-Evans, A. et al. GPR91 senses extracellular succinate released from inflammatory macrophages and exacerbates rheumatoid arthritis. J. Exp. Med. 213, 1655–1662 (2016).