谭蔚泓教授团队：细胞表面核酸适配体链置换反应及应用

来源：研之成理

▲第一作者:李龙 ;通讯作者;李娟，谭蔚泓     

通讯单位：Department of Chemistry, Department of Physiology and Functional Genomics, UF Health Cancer Center, UF Genetics Institute, University of Florida, Gainesville, Florida 32611, USA    

论文DOI：10.1021/jacs.9b07191

研究背景

DNA 链置换天然发生在双链 DNA 复制和转录过程中，化学家近年来在 DNA 纳米技术中扩展了这一概念，并已被用来实现布尔逻辑门，信号恢复，扩增，反馈和与 DNA 支架级联，为各种 DNA 装置的设计，构建奠定了基础。当前的研究现状是该分子机制的应用局限于核酸分子。

研究的核心问题：绝大多数的研究都着眼于核酸分子之间的链置换反应

适配体是被开发用于识别多种生物分子的具有高亲和力和选择性的核酸分子，该功能分子的发现为扩展 DNA 链置换提供了工具和可能性。另一个挑战是如何扩展其在复杂的环境中的应用，比如天然膜的复杂物理化学特性极大地影响了 DNA 适配核酸在复杂生物界面上的行为，限制了该领域的进展。

因此，允许从活细胞膜容易且有效地置换适体的通用策略将有助对于分子置换反应的广泛应用。置换反应的成功应用很大程度上取决于快速动力学，以使适体的内在化等副反应最小化，这可能导致误导细胞内假阳性信号和安全性问题。

研究的盲点：复杂膜结构上蛋白质核酸相互作用关注较少

研究的出发点 

我们先前报道了基于细胞的选择策略（基于细胞的指数富集的配体系统进化技术，或 Cell-SELEX）筛选出了在识别细胞膜上生物标志物的适体，从而丰富和多样化了核酸适体靶标，这也提供了研究复杂膜结构上研究蛋白质核酸相互作用的工具。

在这项工作中，我们尝试了三种简单机制研究了从活细胞表面置换适体的动力学。这三种机制中第一个是利用互补 DNA 进行链置换，这也是最常用的打开核酸适配体三级结构的方法。第二种策略则是一个已经被证明可以极大的提高 DNA 链置换反应动力学的策略，非匹配单链（toehold）介导的链置换。这也是首次该概念应用到核酸适配体和细胞膜蛋白相互作用中。第三种策略利用单链 DNA 结合蛋白进行置换反应。想法则是来自于谭老师组在 2000 年首先利用核酸信标分子研究蛋白质核酸课题中单链结合蛋白展现出的超越互补 DNA同核酸分子信标反应动力学的特性。

此外，开发的方法很容易应用于膜蛋白修饰检测和 Cell-SELEX。这里的关键是快速，完全和无害地置换适体，因为细胞表面蛋白质-适体复合物与 cDNA 之间的置换反应速率非常慢。因此，我们应用前额点介导的链置换和单链 DNA 结合蛋白来克服动力学障碍，并加速适体序列从细胞膜上的置换。

总体概念如图2-1 所示。首先将细胞用适配子 sgc8 饱和，然后侵入 cDNA，确定已标记的 cDNA 或蛋白质，从适配子-细胞复合物中置换出适体序列。Toehold 介导的和 SSB 介导的适体置换表现出显着增强的动力学，并且它们能迅速完全除去适体，从而避免了由适体内在化引起的错误信号。由于其简单性，适体置换实现了两个有趣的功能（1）检测膜蛋白的翻译后修饰，以及（2）提高Cell-SELEX的选择效率。我们预期适体置换反应可能会发现广泛的生物医学应用。

应用拓展   

斯坦福大学 Bertozzi 组首次开发了利用核酸适配体识别靶蛋白就近催化适配体上功能分子与靶蛋白糖基的生物正交反应来实现基于 western blot 选择性的标记和鉴定。我们在这基础上添加适配体链置换反应来移除未共价交联在靶蛋白上的核酸分子，从而使共价标记的分子可以作为糖分子的荧光标记物被用来检测和成像。

基于细胞的 SELEX 被开发来识别不同细胞间的分子水平的生物标志物，但常常受限于比较低效的对于高亲和力分子的分选能力。我们是现代社会发展的重要基石之一。我们尝试了利用 SSB 诱导的链置换反应来增强对于结合能力不同分子的筛选强度。根据结合常数公式，我们可以推导出在相同浓度的 SSB 条件下，弱结合子可以被更有效的筛除。荧光流式监测筛选过程也可以反应出 SSB 组有更高的适配体富集速率。

结论

本课题首先通过实验验证并且发现了三种不同的适体置换反应机理对于从活细胞表面置换核酸适配体的动力学差异。接下来的实验探索了该反应激励在检测膜蛋白的翻译后修饰和提高细胞 SELEX 效率的应用。本课题为提高复杂环境下功能分子反应的动力学提供了新的方法，为开发新型核酸适配体检测机理和为适配体筛选研究提供了研究思路。

个人心得分享

这项工作是从一个非常不成熟的想法慢慢开展出来的，并且希望能更多的从基础生物物理特性入手从而实现在一些具体应用层面能有较大的提升。这项工作也仅仅是一个开端，尽管我们所探索的应用还非常的初步，我认为已经能够略窥其应用意义，我们希望后续可以将其推广到更普适性的层面。

这个课题前前后后做了很久的时间，本来是第一项课题，结果第二个课题已经结题一年之后才完成。主要原因是因为自己挑战一个自己的想法，从最初的不成熟不系统，到推倒重建找到源头不清楚的机制慢慢试验。尽管现在也不能说它已经完美，但已经是一个非常系统的锻炼。这也让我意识到了，我们很多学生一直想做一些有用的设计，但是仅仅靠堆积旧有方法或者简单改造可能是不够的，生物实验之所以做起来困难重重可能就是因为太多的基础机理我们不清楚。所以与其机械的找好方法，不如顺藤摸瓜找找源头，源头上能够理解透彻，后面的工作可能就是水到渠成。

还有重要的一点是数学的应用，实验性学科往往容易忽略数学上的考量。这里的一个很好例子就是我们关于筛选的一个考量，利用核酸适配体结合常数公式加一些推导就可以看得出对于竞争分子不同亲和力分子的一个影响，直观地可以推导到核酸适配体的筛选强度。最后，鼓励大家 work har, work smart, and work together.

文章链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.9b07191