BMC Bioinformatics基于癌细胞等位基因频率改变的生殖系单倍体分型 

来源：Deep Omics

文章题目：Rare variant phasing using paired tumor:normal sequence data

关键词：肿瘤基因组学、VAF、生殖系SNV、单倍体分型

      本文提出了基于肿瘤和正常的配对测序数据进行单碱基变异（SNV）的单倍体分型方法。该方法利用在肿瘤细胞中由拷贝数变化（copy number alteration, CNA）导致的SNV等位基因频率（variant allele frequency，VAF）改变来解析生殖系（germline）SNV单倍体。该方法使用在TCGA数据库的6180个样本上，得到了与其他常用单倍体分型方法高度一致的结果。而且，该方法比其他基于测序片段连通性的方法可以多分型33%以上的位点。

VAF单体型分型方法介绍

       VAF单倍体分型方法基于一个基础并直观的事实。图1A和图1B分别是涉及到的两种不同的情况。图1A中，若正常组织中两个生殖系SNV位点（突变A和G）分别处于同源染色体的两条不同染色体上（即两个单倍体），则当其中某一个片段（或整条染色体）在肿瘤样本中发生拷贝数增加的时候，处于拷贝的片段（或染色体）上的SNV的VAF会随之发生增加，如图1A的突变A。同时，因处于不同的染色体上，另一个SNV位点的突变G的VAF会降低。同理，若两个SNV位点处于同一单倍体上，则两个突变的VAF改变是同步的，即同时增加或减少（图1B）。因此，在肿瘤样本中若发现同一染色体的邻近的不同SNV位点VAF变化是相反的，则表明这两个SNV是不同单倍体，称之为反式分型；若VAF变化是相同的，则表明这两个SNV处于同一个单倍体上，称之为顺式分型。

图1 VAF单倍体分型方法示例及主要步骤。

       基于以上现象，可以通过肿瘤细胞中等位基因频率相较于正常细胞的改变，对生殖系SNV进行单倍体分型。但在做分型前，必须保证以下两点：

分型到同一个单体型的SNV位点需要处于同一个发生拷贝数增加或减少的DNA片段上，即同一个SCNA（Somatic Copy Number Alteration）片段上。

每个参与分型的SNV位点的VAF在正常和肿瘤细胞之间存在显著变化。

图2 采用血液和正常组织均有测序的样本来鉴别SCNA及确定阈值。

       对于第一点，研究人员认为，在同一个SCNA上，各SNV位点的VAF变化绝对值应该是连续且相近的。基于此，研究人员对VAF变化绝对值使用循环二分法（circular binary segmentation，CBS）进行SCNA片段的确定。因为VAF变化绝对值有一定的误差，并且此误差来自于测序序列采样，这种情况下VAF变化并不是由SCNA导致的（图2A）。考虑到这种误差，研究人员使用TCGA中同时有血液和正常组织外显子测序的416例样本做了CBS分段并对分出的249,471个片段的VAF变化绝对值的平均值做了统计（图2B）。结果显示，95%的片段的VAF变化绝对值小于0.14。因为血液和正常组织中理论上是没有SCNA出现的，研究人员使用0.14为判断SCNA的临界值，即在5%的错误率下，片段中SNV位点的VAF变化绝对值的平均值大于或等于0.14时，该片段被判断为SCNA。

       对于第二点，研究人员利用SNV位点的等位基因测序深度做了假设验证（Fisher’s exact test），以判断每个SNV位点是否在统计学上具有显著的VAF变化。只有拥有显著p值的位点才会被考虑进行单体型分型。再次使用416例血液和正常组织的外显子测序数据，研究人员发现对生殖系SNV位点做假设验证的p值遵循了他们期望的分布，p值小于0.05的杂合SNV位点所占比例的中位数为6%（图2C）。然而在肿瘤与对照组织（血液或正常组织）比较中，中位数则为17%（图2D和2E）。

       结合使用 ①VAF变化绝对值的临界值来判断SCNA片段 和 ②对位点做假设验证判断VAF是否有显著变化，研究人员根据VAF的增加和减少对生殖系SNV进行单倍体分型（图1C）。假阳性方面，该方法在416例血液和正常组织的外显子测序数据上，错误地纳入单体型分型的生殖系SNV位点仅占0.3%。

VAF单体型分型方法与常用分型方法的比较（TCGA数据及10x测序）

      研究人员将VAF分型方法在6180个TCGA样本中进行了测试，并将分型结果与HapCUT2、phASER和SHAPEIT的结果进行比较（图3）。结果表明，在HapCUT2和phASER结果相同的位点中，VAF分型方法达到了很高一致性（99%）；而在HapCUT2或phASER独有的位点中，平均有9%的被VAF分型方法成功解析。研究人员发现，将本方法与HapCUT2和phASER结合使用进行单倍体分型时，能很大程度上增加分型位点（平均33%，图3A），并且对HapCUT2和phASER不能作出分型的位点，VAF分型方法平均成功解析了942个（图3B）。

图3 多种分型方法的结果比较。

       研究人员在长距离分型上将VAF方法和SHAPEIT做了比较，并统计了不同长度下两种方法分型结果的一致性（图3C）。在10kb的长度内，VAF方法和SHAPEIT有很高的一致性（>90%）。大于10kb的长度时，两者结果一致性随长度增加而降低。同时，对不常见的SNV变异位点（人群等位基因频率小于0.005），VAF和SHAPEIT的不一致性较高。这是因为SHAPEIT使用人群数据库对个体进行分型时，数据库信息权重会远远超过个体信息。在低人群等位基因频率的情况下，导致结果在个体水平的不准确。同样地，研究人员用COLO829细胞系比较了VAF与10x barcode测序的分型结果，整体一致性达到了99.23%，并且区域长度（<1Mb）和人群等位基因频率对结果几乎没有影响（图3D）。

我们的思考

本文提出了以肿瘤和正常配对样本为基础，利用由SCNA导致的等位基因频率的变化来进行生殖系SNV位点的单倍体分型。与常用的单倍体分型方法（如SHAPEIT，phASER，LongRanger）相比，这种方法不直接借助于测序序列的连通性，也不采用人群单倍体数据库作为参考，消除了来自人群的潜在噪音，并提高了个体单倍体分型的位点数目和准确度。

使用正常配对的血液和组织样本，研究人员建立了一个等位基因频率变化的背景分布，以判断SNV的VAF变化的程度，从而确定SCNA片段，确保分型的准确率。这种通过实际采样进行背景评估的思路值得借鉴。

由于VAF单倍体分型方法依赖于SCNA的存在，并且必须使用肿瘤样本和配对的正常样本，这是其在应用上的一个限制。这说明了，该方法是常用单倍体分型方法在分析肿瘤数据时的一个重要补充。