过去CRISPR系统无法靶向的特异性突变将迎来转机

来源：生物通

麻省理工学院用新方法发现了一种新Cas9酶，仅需1个G的PAM序列PAM将大大增加CRISPR-Cas系统在基因组中潜在靶标数量。过去CRISPR系统无法靶向的特异性突变将迎来转机。新的ScCas9与原来常用的SpCas9共享89.2％的序列相似性，预计其克隆生产以及应用到已有体系或许不会太困难。

CRISPR-Cas9系统需要与靶标相邻的PAM序列以促进Cas9酶识别和结合至该位点（CRISPR靶向特异性是由两部分决定的，一部分是RNA嵌合体和靶DNA之间的碱基配对，另一部分是Cas9蛋白和一个短DNA序列，这个短的 DNA序列通常在靶DNA的3'末端发现，被称为protospacer adjacent motif，PAM）。

目前， SpCas9（ 来自Streptococcus pyogenes）和SaCas9（来自Streptococcus aureus）所识别的PAM序列多含鸟嘌呤/胞嘧啶（G/C-rich），因此利用已报导的碱基编辑系统无法在腺嘌呤/胸腺嘧啶富集（A/T-rich）区域进行精准碱基编辑操作。特别是最常用的SpCas9酶需要GG PAM序列进行识别，以至于其作用限制仅为基因组的9.9％，靶向区域十分局限。

为了解决这个问题，研究小组开发了一种名为SPAMALOT（Search for PAMs by Alignment of Targets）的分析软件（通过目标队列来搜索PAM），对细菌基因组进行生物信息学搜索，以寻找是否存在任何具有限制性较低的PAM的Cas9样酶序列。然后，他们从生物信息学搜索中创建出最佳匹配的合成版本，并评估了它们在CRISPR系统中的效用。

他们发现了一种特别有效的酶ScCas9，与SpCas9有着惊人的相似之处，来自 Streptococcus canis bacteria。有别于双G PAM识别，ScCas9仅需1 个G的PAM序列，这使其在基因组中的靶区域明显大于SpCas9，可以靶向将近50%的基因组区域，研究成果发表在《Science Advances》杂志。

“这种酶看起来几乎与最初发现的酶相同......但它能够靶向常用酶不能的DNA序列，”共同主要作者麻省理工学院Pranam Chatterjee这么解释。

ScCas9的发现为基因治疗带来新希望

过去CRISPR系统无法到达的特异性突变，采用ScCas9后或将迎来转机。例如，基因的典型长度大约为1000个碱基，如果治病目标是敲除单基因的多个不同位置，研究人员可能更倾向选择简单地敲除整个基因。但是，像镰状细胞性贫血这种单一碱基突变引起的疾病，ScCas9酶可以更精确地加以校正。“碱基编辑可不是随意在1000个碱基上打靶，然后乱敲一气，”Jacobson说。“你需要去到非常精确的位置，把CRISPR机器放在它旁边，然后给它一个碱基编辑器（另一个与CRISPR相连的蛋白质），进去修理或改变碱基。”

新工具在这种情况下特别有用。法国国家自然历史博物馆的CRISPR专家Jean-Paul Concordet（未参与本研究）评价：他们完美地利用了链球菌Cas9序列的自然进化，开辟了新基因组编辑工具挖掘的有力途径。

ScCas9与SpCas9共享89.2％的序列相似性，这表明将其整合到CRISPR-Cas9编辑系统的当前模型中应该不太困难。 “ScCas9的氨基酸序列与SpCas9的氨基酸序列密切相关，因此预期它也很容易以重组形式生产，并且有望应用于SpCas9的所有应用。”

“此外，ScCas9使用与SpCas9相同的引导RNA，因此来自不同公司的合成引导RNA可以通用。”

该研究的下一步是继续寻找更多的酶，这些酶可以增加CRISPR系统的靶标范围，同时保持其准确性。与此同时，Chatterjee热情推荐其他人能够在自己的研究中充分利用新酶：“我们很高兴ScCas9能够进入基因组编辑应用家族，并希望获得有关它们的反馈。”

参考文献：

Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog