Nature Methods：何川组搭建逆转录酶进化平台助力检测mRNA修饰

来源：BioArt

转录组上的化学修饰在控制基因表达过程中有着非常重要的作用；然而，很多转录组上的化学修饰还没有合适的方法用来精准检测化学修饰在转录组中的位置，这极大限制了相关的生物化学作用机理的研究。

在检测转录组化学修饰的方法中，一个必要的步骤是通过逆转录酶将RNA逆转录成cDNA，进而通过二代测序的方法检测RNA对应的序列和对应化学修饰的信号。一个常见的定位化学修饰的方法是在逆转录过程中将待检测的修饰位点转化成碱基突变的信号。通常的做法是针对感兴趣的化学修饰去筛选自然界中或者市场上已经存在的逆转录酶，再通过优化反应条件达到应用的目的。然而这样的方式一则受到现有逆转录酶种类的限制；再者，很多RNA修饰对自然存在的逆转录酶不会产生突变，或者有些可以产生突变，但是更多产生的是断裂的逆转录产物，不利于下游二代测序方法的检测。

2019年9月23日，芝加哥大学Bryan C. Dickinson团队与何川团队（第一作者为周慧青博士）在Nature Methods上发表文章Evolution of a reverse transcriptase to map N1-methyladenosine in humanmessenger RNA，利用所开发的“进化”逆转录酶平台精确定位了mRNA上m1A。

在本篇文章的工作中，研究人员搭建了一个拥有荧光筛选机制的“进化”逆转录酶的平台，以带有化学修饰的RNA作为底物，通过逆转录等一系列的生物化学反应，使得逆转录中成功产生碱基突变的逆转录酶发出荧光信号。据此，首先在现有的逆转录酶中引入大量的氨基酸突变，再利用荧光筛选的机制筛选出高效产生碱基突变的逆转录酶的突变种。研究人员首先将这个平台应用在N1-methyladenosine （m1A）的逆转录酶的进化上。m1A 是一种腺苷N1上的甲基化修饰，由于甲基的位阻作用和所携带的正电荷，直接阻碍经典的碱基互补配对。普通逆转录酶会在m1A处因为剪辑配对受阻被迫中止逆转录，而形成的不完全的DNA产物。基于此平台，研究人员改造了源自于HIV病毒中的逆转录酶，使得改造后的逆转录酶能够“越过 ”m1A 产生完整的逆转录DNA产物并且在m1A处产生碱基突变。该突变的信息可以用于二代测序方法中精确定位m1A在转录组中的位置，并且能够估算该位置上m1A的含量。

研究人员采用筛选出的最有效一个逆转录酶变种，检测出人类细胞 (HEK-239T) 转录组的单碱基分辨率的m1A图谱，利用特异性识别m1A的抗体在转录RNA上发现了两百多个m1A位点，为今后m1A的生物研究和检测提供了数据库和有效的检测手段。同时，作者们所搭建的逆转录酶的进化平台亦适用于改造配合二代测序用来检测其他RNA化学修饰的逆转录酶,为将来准确检测转录组中多种RNA化学修饰提供了新的可能。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41592-019-0550-4