NBT： ABE单碱基编辑器的新风险——介导胞嘧啶的脱氨基化

来源：BioArt

目前已知的人类致病遗传变异中，约58%都属于点突变，而接近半数的致病点突变都属于G·C--A·T变异【1】。2017年底哈佛大学David Liu实验室开发出新型单碱基编辑器ABE（Adenine Base Editor），可实现A·T--G·C碱基对的转换，这对上述的近半数点突变遗传病的治疗有重要意义，因而在基因治疗领域的应用前景相当广阔【2】（详见：突破丨Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC）。不过，2019年多项研究指出，ABE系统存在大量的RNA脱靶，好在研究者通过点突变的策略成功的降低了ABE系统在RNA水平的脱靶，改善了ABE系统的安全性【3-5】（专家点评Nature | 杨辉/郭帆/李亦学等开发更高精度的单碱基基因编辑工具，全面降低RNA脱靶风险）。此外，有研究者在应用ABE系统时注意到，部分位点上的胞嘧啶（C）有一定的概率会被编辑为其它碱基【6-8】，这一现象是意外还是有深层次的机制？目前依然无人知晓。

2019年9月23日，来自韩国汉阳大学化学系的Sangsu Bae实验室与首尔国立大学的Jin-Soo Kim实验室合作在Nature Biotechnology杂志上发表了题为Adenine base editors catalyze cytosine conversions in human cells的论文。文章对ABE系统介导胞嘧啶（C）编辑的能力进行了系统分析。文章证实ABE系统编辑胞嘧啶（C）的能力并非偶然，它能编辑位于sgRNA位点5-7位（PAM为21-23位）的TC*N序列中的胞嘧啶（C），该能力独立于其介导A·T--G·C碱基对转换的能力，且最高效率可达11.2%。

此前关于ABE系统编辑胞嘧啶（C）的证据太少，难以总结规律。因此研究者设计了22种sgRNA以检测ABE系统编辑胞嘧啶（C）的能力，结果发现其对2种sgRNA上第六位的胞嘧啶（C）有编辑能力，其编辑效率约为10%。更进一步，研究者指出，ABE系统是通过直接介导胞嘧啶（C）的脱氨基化完成单碱基编辑，表明ABE系统具备部分CBE（cytosine base editor）的能力。

明确了ABE系统编辑胞嘧啶（C）的能力之后，研究者对影响ABE介导胞嘧啶（C）脱氨基化的DNA序列特性进行了综合分析，即探讨邻近序列对胞嘧啶（C）脱氨基化效率的影响。结果发现，TC*序列的脱氨基化效率显著高于A/G/CC*序列；除5’端序列之外，胞嘧啶（C）的3’端序列对其脱氨基化效率有部分影响，C*Y（Y=T/C）的编辑效率略高于C*R（R=A/G）。此外，研究发现，ABE系统对胞嘧啶（C）的编辑并不受其编辑腺嘌呤（A）能力的影响，当活性窗口中并无腺嘌呤（A）时，ABE系统依然可以编辑活性窗口中的胞嘧啶（C）。就活性窗口而言，ABE系统编辑胞嘧啶（C）的窗口与其编辑腺嘌呤（A）的类似，主要编辑位于sgRNA位点5-7位（PAM为21-23位）的胞嘧啶（C），其中尤以第6位的编辑效率最高。

总体而言，本研究首次系统性的分析并证实了ABE系统介导胞嘧啶（C）脱氨基化的能力，这一结果再次提醒研究者，单碱基编辑系统的安全性依然有提升的空间；不过研究结果也提示，ABE系统具备用作胞嘧啶（C）编辑工具的潜力，其独特的编辑特性或可拓宽现有CBE工具的适用范围。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-019-0254-4

参考文献

1. Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet (2018).

2. Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464-471 (2017).

3. Grunewald, J. et al. Transcriptome-wide off-target RNA editing induced by CRISPR-guided DNA base editors. Nature 569, 433-437 (2019).

4. Rees, H.A., Wilson, C., Doman, J.L. & Liu, D.R. Analysis and minimization of cellular RNA editing by DNA adenine base editors. Sci Adv 5, eaax5717 (2019).

5. Zhou, C. et al. Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by mutagenesis. Nature 571, 275-278 (2019).

6. Liu, Z. et al. Efficient generation of mouse models of human diseases via ABE- and BE-mediated base editing. Nat Commun 9, 2338 (2018).

7. Lee, H.K. et al. Targeting fidelity of adenine and cytosine base editors in mouse embryos. Nat Commun 9, 4804 (2018).

8. Grunewald, J. et al. CRISPR DNA base editors with reduced RNA off-target and self-editing activities. Nat Biotechnol 37, 1041-1048 (2019).