Mol Cell ：严振鑫/薛超友等发现同源重组蛋白Rad52的新调控功能

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DNA双链断裂（Double-strand break, DSB）是危害最严重的DNA损伤形式。未被正确修复的DSB会导致染色体缺失或重排，进而引发基因组不稳定、癌症和细胞死亡。因此双链断裂的正确修复对保持基因组的完整性和细胞的存活至关重要。双链断裂的修复机制包括同源重组（homologous recombination, HR）和非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）。HR途径以同源序列为修复模板，保真性高。而NHEJ不依赖于模板，保真性低，容易造成碱基对的插入或缺失。

HR的第一步是通过5' 末端切除来产生长链3' 单链DNA（ssDNA），此过程称为End rep。3' ssDNA首先与单链DNA结合蛋白（RPA）结合，然后在多个重组介导蛋白的帮助下进一步形成RAD51-DNA 复合物。DNA 5' 末端的切除促使了DSB的修复通过高保真的HR进行。在真核生物中，Mre11-Rad50-Xrs2 (MRX, 在人细胞中为MRE11-RAD50-NBS1 (MRN)) 与Sae2(CtIP) 首先沿着5' 末端切除，产生一小段3' ssDNA。这一小段3' ssDNA进而被Exo1核酸外切酶或者是RecQ解旋酶（在裂殖酵母中为Rqh1，芽殖酵母中为Sgs1，在人细胞中为BLM 或者WRN）和Dna2核酸酶识别。随后Exo1或者Sgs1-Dna2沿着5'-3' 方向进一步切除其中一条DNA链，形成长链3' ssDNA。有意思的是，在一些真核细胞中，两条途径的效率并不相同。比如在裂殖酵母细胞中，Exo1途径参与了大部分的5' 末端切除，Rqh1-Dna2仅参与了一小部分5' 末端切除。目前这种5' 末端切除途径偏好性的机理还不清楚。 

2019年9月18日，来自美国贝勒医学院的Grzegorz Ira实验室，哥伦比亚大学的Eric C. Greene实验室和耶鲁大学与德州大学圣安东尼奥医学中心的Patrick Sung实验室（共同第一作者为Ira实验室博士生严振鑫，Greene实验室博士后薛超友博士和Ira实验室的Sandeep Kumar博士）在Molecular Cell 杂志上发表了题为“Rad52 restrains rep at DNA double strandbreak ends in yeast”的研究论文，揭示了同源重组蛋白Rad52 在 5' 末端切除过程中对Rqh1 (Sgs1)-Dna2途径的下调作用，对Exo1途径却没有显著影响，在一定程度上解释了5' 末端切除途径的偏好性。

研究人员同步化地在裂殖酵母（S. pombe）基因组的特异位点产生一个DSB，通过Southern Blot来监测5’末端切除的动态。研究人员首先敲除了一些前文提到的5'末端切除途径中的关键蛋白，这些蛋白的敲除不同程度地抑制了5' 末端切除。有意思的是，rad52基因敲除显著的促进了5' 末端切除，同时Rad52蛋白过量表达显著地抑制了5' 末端切除。通过对一系列rad52基因的突变菌株的研究显示Rad52蛋白的DNA结合与DNA复性（annealing）活性以及不保守的C端结构域在5' 末端切除的抑制中发挥作用。进一步遗传分析显示Rad52特异性抑制Rqh1-Dna2途径而非Exo1途径。ChIP-qPCR结果显示Rad52抑制了Rqh1解旋酶在DSB附近的富集，而对Exo1的富集没有影响，这与遗传分析的结果一致。随后研究人员发现在芽殖酵母中Rad52同样能特异地抑制参与5' 末端切除的Sgs1-Dna2途径。

最后，研究人员利用单分子DNA帘技术在单分子的水平上研究了Rad52对Sgs1 5' 末端切除途径的影响。通过对 Sgs1 5' 末端切除过程进行实时单分子成像，研究人员发现Rad52在三个方面影响Sgs1 5' 末端切除过程。在5' 末端切除过程中，Sgs1会首先与MRX所产生的一小段3' ssDNA结合进而启动5' 末端切除。研究发现Rad52蛋白可以特异性的踢除已经与3' ssDNA结合的Sgs1。同时 Rad52还能直接与3' ssDNA结合来抑制Sgs1与后者相结合。此外，Rad52蛋白还能抑制Sgs1 的ATP 水解活性和移位速率。这些实验在该研在分子水平上揭示了 Rad52调控Sgs1 途径的机制。

总之，这篇文章在裂殖酵母和芽殖酵母中均发现了Rad52对DSB的5'末端切除的抑制作用，并在体内和体外两个水平系统地阐述了其中的调控机制。Rad52对Rqh1 (Sgs1)途径的特异性抑制作用为细胞在Exo1和Rhq1（Sgs1）介导的两种途径的调控方式提供了一种可能的解释。这种调控机制在高等生物中是否保守还需要更多的研究来确认。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.08.017