陈兴团队揭示ESRRB O-GlcNAc修饰调节小鼠胚胎干细胞的多能性 ​

来源：BioArt

原标题：Nat Comm：陈兴团队利用新一代非天然糖探针揭示ESRRB O-GlcNAc修饰调节小鼠胚胎干细胞的多能性 ​

糖基化，这类从病毒到真核细胞都存在的翻译后修饰发挥着非常重要的生物学作用，但是这类模块化组装的聚合物由于不受基因编码的直接调控，无论是糖型鉴定还是糖基化修饰调控，都是非常棘手的【1】。探究糖基化修饰的蛋白底物，传统的方式是利用各种各样的凝集素、抗体以及基于糖的多羟基特点设计的材料如HILIC等【2】。90年代末，由著名的糖化学生物学家，美国科学院院士Carolyn Bertozzi教授课题组将生物正交反应应用到代谢领域，开发了强大的非天然糖代谢标记技术【3】，这类利用全乙酰基保护的非天然糖携带了生物相容性高的正交基团，通过良好的脂溶性进入细胞，之后被细胞的各类酶误认为是天然单糖，进而代谢到糖缀合物中【4】。这类探针已经实现了对细胞，斑马鱼及小鼠组织等糖基化的成像和糖蛋白组学分析【5,6】，极大地推进了糖基化研究的领域发展。

非天然糖代谢路径示意图及化学结构式【5】

直到去年北京大学化学与分子工程学院陈兴教授课题组发现，这类传统的探针会带来严重的非酶催化的半胱氨酸的糖基化修饰【7,8】。为了解决这个副反应问题，继续推进非天然糖在代谢标记领域的长期应用和发展，2019年9月6日，陈兴课题组在Nature Communications上以长文形式发表了题为Next-generation unnatural monosaccharides revealthat ESRRB O-GlcNAcylation regulates pluripotency of mouse embryonic stem cells的论文，文章报道了新一代的探针1,3-Pr2GalNAz (乙酰半乳糖胺的叠氮类似物1号位和3号位羟基被丙酰基修饰)，并首次利用该探针对小鼠胚胎干细胞转录因子ESRRB的O-GlcNAc修饰位点进行了探究，发现ESRRB的25位丝氨酸被O-GIcNAc修饰后增强其稳定性，促进其转录活性，并且促进其与OCT4和NANOG这两个主要多能调节因子的相互作用，进而对干细胞的自我更新及多能性维持非常重要。

 O-GlcNAc是一种非经典的蛋白质糖基化修饰，由一个GlcNAc单糖通过β糖苷键连接于众多细胞内蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基上。更为重要的是，O-GlcNAc糖基化修饰是高度动态可逆的，由一对酶OGT和OGA负责细胞核和线粒体中总共数千种蛋白的O-GlcNAc修饰和去修饰，非天然糖代谢探针GalNAz已经大量应用在O-GlcNAc修饰的研究中【9,10】。为了增加GalNAz的膜通透性，乙酰基的引入同时也会产生非酶催化的半胱氨酸糖基化修饰【7】，文章中报道未修饰的GalNAz才能避免副反应的发生，但是有效地标记工作浓度需要毫摩尔级，严重限制非天然糖探针的应用。因此，作者开发了高代谢效率，高特异性的探针。

首先，研究人员利用细胞裂解液与GalNAz，部分及全部乙酰基修饰的GalNAz和1,3位丙酰基修饰的GalNAz进行体外孵育反应，然后进行CuAAC反应后胶内荧光检测，发现化合物4，即1,3-Pr2GalNAz脂溶性好，而且没有非酶催化的半胱氨酸糖基化修饰副反应。并且作者利用HeLa细胞进行代谢标记，结合糖基化修饰位点信息的实验比较了GalNAz、Pr2GalNAz和Ac2GalNAz效率，发现较低工作浓度Pr2GalNAz就可以获得更多的O-GlcNAc修饰的位点信息，而且没有引入半胱氨酸糖基化修饰的副反应。

在之前的研究中，敲除小鼠OGT基因导致胚胎致死，表明O-GlcNAc糖基化修饰在胚胎生长发育中承担着必不可少的功能【11】，因此，为了全面且清晰的阐述O-GlcNAc糖基化修饰究竟如何在胚胎干细胞的生长发育与多能性维持等生命活动中发挥作用，该探针应用于mESC的O-GlcNAc 修饰的蛋白质组学及位点的研究。文章中发现转录调控网络中重要的因子ESRRB可以被Pr2GalNAz及化学酶法很好的标记，同时找到了ESRRB关键的O-GlcNAc修饰的位点Ser 25。

紧接着，文章中证明ESRRB的稳定性响应OGT的抑制剂Ac45SGlcNAc，而且从瞬转实验中发现Ser 25的糖基化修饰和ESRRB的稳定性相关，而且通过CO-IP实验发现S25A突变会减弱ESRRB与OCT4、NANOG的相互作用，同时ESRRB也响应OGA抑制剂Thiamet-G (TG) ，也通过荧光素酶实验验证了Ser25糖基化对ESRRB的转录活性影响。

最后，文章中利用克隆形成实验和成瘤实验验证了Ser 25糖基化对小鼠胚胎干细胞的多能性和自我更新能力的维持具有非常重要的作用。

亮点: 非天然糖探针代谢标记过程始终是一个“黑箱子”，之前的工作并没有全面细致探究非天然糖探针最终以什么样的连接形式整合到蛋白的什么位置，且传统的糖基化蛋白质组学技术缺乏关键的位点信息，并不能很好地区分“真假糖蛋白”。因而北大化院陈兴课题组揭示了近二十年来第一代非天然糖出现的非酶催化的副反应可能对整个糖蛋白质组学的影响，文章工作中开发的新一代探针及时解决了该领域的关键问题，对整个糖生物学领域研究具有深远的影响力。

据悉，北大化学院，生命科学联合中心的陈兴教授为本研究论文的通讯作者，北大-清华生命科学联合中心博士研究生郝熠同学和北大化学院博士研究生范欣琦同学为论文的共同第一作者。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-019-11942-y

制版人：小娴子

参考文献

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3 Mahal,L. K., Yarema, K. J. & Bertozzi, C. R. Engineering Chemical Reactivity onCell Surfaces Through Oligosaccharide Biosynthesis. Science 276, 1125-1128,doi:10.1126/science.276.5315.1125 (1997).

4 Laughlin,S. T. & Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proceedings of the National Academy of Sciences 106, 12-17, doi:10.1073/pnas.0811481106(2009).

5 Palaniappan,K. K. & Bertozzi, C. R. Chemical Glycoproteomics. Chemical Reviews 116,14277-14306, doi:10.1021/acs.chemrev.6b00023 (2016).

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7 Qin,W. et al. Artificial CysteineS-Glycosylation Induced by Per-O-Acetylated Unnatural Monosaccharides duringMetabolic Glycan Labeling. Angew Chem IntEd Engl 57, 1817-1820,doi:10.1002/anie.201711710 (2018).

8 Qin,W. et al. S-glycosylation-basedcysteine profiling reveals regulation of glycolysis by itaconate. Nature Chemical Biology,doi:10.1038/s41589-019-0323-5 (2019).

9 Boyce,M. et al. Metabolic cross-talk allowslabeling of O-linked beta-N-acetylglucosamine-modified proteins via theN-acetylgalactosamine salvage pathway. ProcNatl Acad Sci U S A 108,3141-3146, doi:10.1073/pnas.1010045108 (2011).

10 Yu,S. H. et al. Metabolic labelingenables selective photocrosslinking of O-GlcNAc-modified proteins to theirbinding partners. Proc Natl Acad Sci U SA 109, 4834-4839,doi:10.1073/pnas.1114356109 (2012).

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