双响应 DNA 探针结合纳米孔传感器用于蛋白酶活性及周围环境 pH 的同时检测

来源：研之成理

▲共同第一作者：刘蕾，游依;共同通讯作者：吴海臣 研究员

通讯单位：中国科学院化学研究所

论文DOI：10.1002/anie.201907816

由于肿瘤等恶性疾病目前仍缺乏有效的早期诊断方法，因此在病人确诊后肿瘤通常已发展至晚期阶段导致其五年存活率常低于 10 %，所以发展行之有效且结果可靠的肿瘤早期诊断方法对于挽救患者生命有着重要意义。研究发现，人体某些生物标志物的突然表达或表达水平异常通常伴随着特定疾病的发生，因此对这些相关的生物标志物进行高灵敏度、同时检测不仅是肿瘤早期诊断方法发展与建立的重要突破口，而且对风险评估、个性化治疗方案制定以及预后监控都有着重要意义。尽管目前已有多种方法可以高灵敏度、高选择性地检测各类生物标志物，然而都难以实现对多种相关生物标志物的同时检测，导致检测费时费力且通量较低，因此发展简单、经济、快捷、高效的生物标志物同时检测方法将极大地推动肿瘤早期诊断事业的发展。

纳米孔单分子技术起源于 20 世纪 90 年代，其基本原理是待测分子穿越纳米孔时将与其发生模式各异的分子间相互作用进而调制离子电流从而输出不同种类的指纹电流信号。由于分子的性质由其结构决定，因此通过分析指纹电流信号将得到关于待测分子结构、形态、尺寸、电荷状态等丰富的物性信息。目前纳米孔单分子技术在 DNA 测序、单分子反应机理探究、生化分析检测等领域扮演了越来越重要的角色。

在肿瘤发生及恶化的一系列过程中，蛋白酶由于对肿瘤的血管生成、入侵及转移等过程起到至关重要的作用而被单独列为一类标志物用于肿瘤的早期诊断。除此之外，肿瘤组织的酸性微环境也常被作为关键指标用于指示癌症的发生。尽管目前已有很多方法手段可以检测蛋白酶的浓度、活性以及肿瘤组织微环境的酸碱度，然而至今仍鲜有可同时检测这两种指标的有力手段。

中国科学院化学研究所的吴海臣研究员及其团队近年来在 DNA 探针结合纳米孔传感器用于各类生物标志物的高灵敏度同时检测领域取得了一系列重要成果。该课题组前期研究发现在单链 DNA 的链中间通过点击化学反应连接二茂铁 ⊂ 葫芦脲 [7] 主客体单元（Fc⊂CB7）后，该 DNA 分子穿越 a 溶血毒素纳米孔（aHL）将产生模式极为特征的电流信号而可用于分子指认。受此启发，该团队最近发现在单链DNA末端修饰N-末端苯丙氨酸的小肽后，苯丙氨酸同样可与 CB7 发生主客体作用而形成 DNA 探针。该探针穿越 aHL 将产生两种特征性的电流信号，并且这两种信号的比率具有 pH 依赖性。基于此原理，他们设计了具有双重响应功能的 DNA 探针用于同时检测蛋白酶的浓度和肿瘤组织酸碱度（图1）。

▲图1 DNA 双响应探针的传感原理

研究发现亮氨酸氨肽酶（LAP）参与了肿瘤细胞增殖、入侵、血管生成、肝损伤等一系列病理过程，因此被认为是一种重要的肿瘤标志物。LAP 与其对应的 DNA 探针作用后将切除多肽 N-端的亮氨酸而使预先设计的苯丙氨酸暴露出来。该探针与 CB7 作用后穿越 aHL 所产生的特征信号可用于 LAP 的定量检测；通过不对称盐梯度信号放大策略，该方法可检出样品中低至 3.1 fM 的 LAP，是迄今为止所报道的最低检测限。

此外，由于信号频率与分子浓度呈正相关，因此把信号频率与底物浓度的关系作出 Lineweaver-Burk 图将得到用于描述酶活性的米氏常数。不仅如此，研究还发现两种特征信号的比率仅依赖于环境 pH 而与探针的量无关，因此利用这种双重响应探针首次成功实现了对酶活性与肿瘤环境酸碱度的同时检测（图2）。

▲图2 DNA 双响应探针同时检测 LAP 的浓度、活性以及周围环境的酸碱度

由于多肽作为识别单元具有极高的设计灵活性，因此还可根据待测蛋白酶的性质设计信号猝灭型的 DNA 探针。如图3 所示，当组织蛋白酶 B（cat. B）特异性地切掉缬氨酸-瓜氨酸单元后，用于特征信号输出的苯丙氨酸-葫芦脲主客体结构也随之脱落，造成特征信号频率猝灭。通过信号的猝灭程度以及信号比率同样可对  cat. B 的浓度、活性、pH 进行准确定量。cat. B 则由于其在多种恶性肿瘤的细胞外与细胞周基质中过表达而被作为一种标志物用于肿瘤诊断。

▲图3 DNA 双响应探针同时检测 cat. B 的浓度、活性以及周围环境的酸碱

由于该工作设计的 DNA 探针中的多肽部分既作为底物识别单元也作为信号输出单元，因此使得该策略具有极高的灵敏度与检测效率，并且可有效避免背景干扰等问题。由于 DNA 具有高度的可修饰性以及丰富的 “toolbox” 功能，因此该工作为 DNA 探针用于复杂体系乃至单个细胞中的多组分同时检测提供了新的思路与方法。

相关工作发表于 Angew. Chem. Int. Ed.上。

文章链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.201907816