Nature ：利用修正基因治疗肌肉营养不良症

来源：BioArt

先天性肌营养不良（congenital muscular dystrophy, CMD）属常染色体隐性遗传疾病，临床表征为肌无力和肌张力低，可伴有不同程度中枢神经系统受累。其亚型先天性肌营养不良1A型（congenital muscular dystrophy type 1A， MDC1A），因编码层黏连蛋白α2的 LAMA2 基因发生突变导致。蛋白α2与β1 和γ1形成三聚体Laminin-211，通过与营养不良糖蛋白α（dystroglycan-α）和α7β1整合素相互作用以维持肌管细胞（myotubes）的稳定和施旺细胞（Schwann cells）的生成。之前的研究表明，通过使用Crispr-Cas9方法对Lama2基因突变修正，是很有效果的治疗方法【1】。然而，目前已确定的引起MDC1A的Lama2的突变超过350种，针对每种突变都要设计相应的治疗方法并进行评估，这无疑增加了治疗负担，同时加大了Crispr-Cas9技术的脱靶效应。此外，已有研究报道，编码层黏连蛋白α1（Lama1）因为与Lama2结构相似，通过增加编码层黏连蛋白α1（Lama1）的表达，可以帮助缓解该疾病小鼠模型的症状【2,3】，因此Lama1被称之为修正基因（modifier gene）。但这种方法的局限性在于LAMA1基因较大，递送LAMA1基因的常规基因治疗方法难以实现。

2019年7月25日，来自加拿大Hospital for Sick Children Research Institute的Ronald D. Cohn教授团队在Nature杂志上发表了名为A mutation-independent approach for muscular dystrophy via upregulation of a modifier gene的研究论文，该研究团队开发了一种基于CRISPR的基因激活技术，通过在小鼠中上调Lama1基因的表达，预防并一定程度逆转小鼠肌肉萎缩症状。更重要的是，无论该疾病Lama2突变类型如何，该疗法都可进行治疗。

以往的研究发现，通过使用携带催化失活的Streptococcus pyogenes (Sp) dCas9方法能够很好地在细胞系当中高表达修正基因【4,5】，而SpdCas9的蛋白过大，难以包装到AAV9病毒载体当中，从而使得体内治疗难以实现。因此，研究人员首先突变了蛋白较小的SaCas9，构建了SadCas9。通过使用SadCas9系统，在肌细胞C2C12当中对5个sgRNA靶向效率进行了检测。接下来，研究人员进一步构建了Flag标记的SadCas9-2XVP64质粒，分别联合一个sgRNA和三个sgRNA，通过腺相关病毒（AAV9）型病毒载体传递，对3个月大的MDC1A （dy2j/dy2j）小鼠进行肌肉注射后发现，相比于对照组（即没有sgRNA组），带有sgRNA的两组小鼠内Lama1的表达显著上调，同时，H&E染色也显示肌肉结构也有明显的改善。这说明Lama1蛋白水平的提高能够有效的改善肌肉纤维化程度。

接下来，研究人员通过对3个月大且已经明显出现肌肉纤维化和后肢瘫痪症状的小鼠进行尾静脉注射AAV9载体治疗。在小鼠7周大时，对小鼠强制性张力（Tetanic force）、神经传导（Nerve conduction）和分子生物学检测发现，高表达Lama1能够显著改善肌肉功能和纠正髓鞘生成缺陷，瘫痪小鼠的运动能力也得到了显著的提高。这说明Lama1蛋白水平的提高能够抑制该疾病的恶化并一定程度上逆转疾病的发展。  

总的来说，本研究通过运用dCas9的方法，通过腺相关病毒AAV9体内调节MDC1A的小鼠模型中Lama1的表达，改善了已经出现症状的动物的疾病进展，为人类MDC1A疾病治疗提供了强有力的证据，同时，也为其他肌肉相关疾病如杜氏肌肉营养不良症（Duchenne muscular dystrophy）的治疗提供新思路。

参考文献

[1] Kemaladewi, D. U. et al. Correction of a splicing defect in a mouse model of congenital muscular dystrophy type 1A using a homology-directed-repairindependent mechanism. Nat. Med. 23, 984–989 (2017).

[2] Gawlik, K., Miyagoe-Suzuki, Y., Ekblom, P., Takeda, S. & Durbeej, M. Laminin α1 chain reduces muscular dystrophy in laminin α2 chain deficient mice. Hum. Mol. Gene13, 1775–1784 (2004).

[3] Gawlik, K. I., Harandi, V. M., Cheong, R. Y., Petersén, Å. & Durbeej, M. Laminin α1 reduces muscular dystrophy in dy2J mice. Matrix Biol. 70, 36–49 (2018).

[4] Perez-Pinera, P. et al. RNA-guided gene activation by CRISPR–Cas9-based transcription factors. Nat. Methods 10, 973–976 (2013).

[5] Wojtal, D. et al. Spell checking nature: versatility of CRISPR/Cas9 for developing treatments for inherited disorders. Am. J. Hum. Genet. 98, 90–101 (2016).