基于定点酶切机制的恒温指数扩增反应高特异性检测RNA单碱基突变

近日，陕西师范大学刘成辉教授团队提出了一种基于RNase H定点酶切机制的恒温指数扩增反应体系，无需任何反转录步骤，实现了mRNA单碱基突变的高特异性检测。常规应用中，RNase H被广泛用于水解DNA/RNA杂合双链结构中的RNA序列，但其对RNA序列的酶切位点具有随机性。不同于常规体系，该团队创新设计了嵌合若干二氧甲基修饰碱基的单链核酸探针（cmDNA），用于mRNA突变位点的特异性识别并引导RNase H只能在RNA突变位点进行高选择性酶切。该cmDNA探针与突变mRNA（mutRNA）完全互补，与野生型mRNA（wtRNA）存在单碱基错配，在合适的温度下，cmRNA只与mutRNA互补结合使得RNase H在mutRNA的突变位点处进行定点切割，暴露出位置确定的3'-OH末端，进而能够引发后续高效的恒温指数扩增反应（EXPAR）。同时，由于单碱基错配引起的热力学差异，正常的wtRNA不能与该cmDNA探针杂交而无法被RNase H水解，即便在体系中随机形成少量的wtRNA/cmDNA结构，由于在识别位点处的碱基错配，也会进一步阻止RNase H的定点酶切，不能引发后续的EXPAR反应。

因此，cmDNA辅助的RNase H定点酶切机制有效地避免了野生型wtRNA潜在的假阳性干扰，结合高灵敏度EXPAR扩增体系，实现了对特定位点mRNA突变的准确检测。值得注意的是，该方法可以通过简单地改变2'-O-甲基修饰DNA探针的碱基序列来实现对不同mRNA突变位点的检测，具有良好的通用性。

图1. 基于RNase H定点酶切机制的EXPAR体系特异性检测突变mRNA示意图

在该体系中，嵌合二氧甲基修饰碱基的cmDNA是实现高特异性mutRNA定点切割的关键。为了验证其关键作用，该课题组同时设计了一种具有相同序列的、无任何修饰的DNA探针 (nDNA) 与之进行对比分析，发现两种探针对于mutRNA 的特异性检测结果有明显差异。当使用nDNA时（图2b），wtRNA与空白体系（无任何RNA）所产生的荧光信号有明显区分，表明wtRNA产生了明显的假阳性信号，导致在大量wtRNA背景下无法准确检测少量的mutRNA。相比之下，使用cmDNA时（图2a），wtRNA与空白体系所产生的荧光信号完全相同, 证明了wtRNA不会对mutRNA的检测产生干扰，实验结果准确度明显提高。电泳实验（图2c）同时也证明了在使用cmDNA时，只有mutRNA被RNase H在特定位点切割，而wtRNA 不会受到RNase H的作用。因此，该体系为高特异性、高准确度地检测突变mRNA提供了一种新的策略。

图2. 嵌合二氧甲基修饰碱基的cmDNA对RNase H定点酶切及特异性检测突变mRNA的关键作用该成果近期发表在Chemical Communications 上，陕西师范大学硕士研究生常福和博士研究生孙月莹为本文共同一作，刘成辉教授和李正平教授为共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金及教育部长江学者与创新团队滚动支持计划等项目的资助。