新型CRISPR平台扩展RNA编辑能力

IMAGE: The CRISPR family enzyme Cas13 at work. Cas13 (pink), is at the heart of the RESCUE platform, where it uses a special guide (red) to target RNAs in the cell... view more 

Credit: Image: Stephen Dixon

CRISPR基因编辑技术自问世以来，已彻底改变了我们对基因进行编辑的能力。CRISPR技术所涵盖的工具越来越多，它们可以操控基因及其表达，包括用Cas9和Cas12酶靶向DNA，用Cas13酶靶向RNA。CRISPR工具箱提供了处理突变的各种方法。由于RNA存活时间相对较短，仅短暂地对RNA中与疾病相关的基因突变进行修改可以避免对基因组造成永久性的改变。除此之外，采用CRISPR/Cas9系统介导的DNA编辑仍然难以编辑神经元等细胞类型，亟需新方法来治疗影响大脑的致命疾病。

麦戈文脑科学研究所研究员、哈佛-麻省理工博德研究所核心成员张锋及其团队已经开发出这种技术，并将其命名为RESCUE（胞嘧啶向尿嘧啶特异性变化的RNA编辑系统，可实现从C到U的RNA编辑）。该成果于今日发表在《科学》期刊上。

张锋、共同第一作者Omar Abudayyeh 和Jonathan Gootenberg（目前均为麦戈文脑科学研究所研究人员）以及其他团队成员利用失活的Cas13，将RESCUE引导至RNA转录物中胞嘧啶碱基靶标的位置，并采用新的、经过进化的、可编辑的酶将不需要的胞嘧啶转化为尿苷，从而改变RNA指令。张峰团队此前曾开发出REPAIR技术，可将RNA上的腺嘌呤转化为肌苷，在此基础上，RESCUE应运而生。

RESCUE技术的出现大大扩展了CRISPR工具的靶向范围，使其能涵盖蛋白质磷酸化位点等可修饰的位点。这些可修饰的位点是蛋白质活性的开关，主要存在于细胞信号分子和癌症相关的信号通路中。

“针对致病基因变异的多样性，我们需要拥有一系列的精准基因编辑技术。通过开发这种新酶并将它和CRISPR的可编程性、精准性结合，我们成功填补了现有CRISPR工具箱的一大空白，”张峰教授说。张峰既是麻省理工学院麦戈文脑研究所的James &Patricia Poitras神经科学教授，也在麻省理工学院的大脑与认知科学及生物工程系任职。

扩展RNA编辑的靶标范围

此前开发的RNA 编辑系统REPAIR将靶向RNA的CRISPR/Cas13与ADAR2酶结合在一起，然后导向特定的RNA位置，特异性地将RNA上的腺嘌呤碱基（A）转化为肌苷（I）。在此基础上，张峰及其团队在实验室中对REPAIR编辑系统进行改进和升级，直至其能够将RNA中的胞嘧啶（C）转化为尿苷（U），这就是全新的RESCUE编辑系统。

RESCUE编辑系统可被引导至任何选定的RNA，并通过优化的ADAR2组件平台执行由C到U的编辑。研究人员还将这一全新平台应用到人类细胞中，证明了RESCUE不仅可以靶向合成RNA中24种临床相关的基因突变，也可以靶向人类细胞中的天然RNA。此后，研究人员又进一步优化了RESCUE，在减少脱靶编辑的同时，同时最小化目标内基因编辑的干扰。

新靶标轮廓初现

RESCUE系统的问世大大扩展了CRISPR编辑工具的可编辑范围，意味着许多调节蛋白质活性与功能的修饰位点（如磷酸化、糖基化和甲基化位点）都可作为编辑的靶标。

不同于DNA层面上的编辑修改所带来的对基因组不可逆的永久性改变，RNA编辑的一大优势是它的可逆性，因为RNA只是DNA转录出来的中间产物。因此，在需要暂时而非永久性改变时，RESCUE就可以发挥其独特优势。为证明这一点，研究团队在人类细胞中使用RESCUE来编码β-连环蛋白上的RNA特定位点（已知其在蛋白质产物上被磷酸化的位点），从而暂时激活β-连环蛋白并促进细胞生长。如果这样的改变是永久性的，细胞生长就会失控并引发癌症。现在有了RESCUE编辑系统，我们可以将其用于急性损伤时，暂时激活细胞增长而促进伤口愈合。

研究人员还将目光瞄准了致病变异基因APOE4。APOE4等位基因一直是晚发型阿尔兹海默病的遗传风险因素。与APOE4只有两个碱基区别的APOE2（APOE4中两个都是C，APOE2中两个都是U）却完全无害。于是，张峰及其团队将APOE4 RNA导入细胞中，通过RESCUE系统将两个碱基C都转化为U，从而将危险因素APOE4转化为无害的APOE2。

为了进一步将RESCUE编辑系统推向临床应用，也为了让研究人员通过RESCUE更好地用于学术研究，张峰实验室计划与学术界共享RESCUE编辑系统，实验室此前开发的CRISPR工具也都与学界免费共享。研究人员可通过非营利性质粒库Addgene免费获得该项技术，用于学术研究。您可登陆张峰实验室网站获取更多信息。

该研究受到了以下各方的支持：菲利普斯家族；James Poitras和Patricia Poitras；波特拉丝精神疾病研究中心；谭浩克与杨华沙自闭症研究中心；罗伯特·梅特卡夫；David Cheng；Omar Abudayyeh的国立卫生研究院F30拨款、美国国家研究服务奖1F30-CA210382拨款；张峰是纽约干细胞基金会的罗伯森研究员，受到美国国立卫生研究院拨款支持（1R01-HG009761, 1R01-222 MH110049, and 1DP1-HL141201）；霍华德休斯医学研究所；纽约干细胞基金会和Harold & Leila Mathers基金会。

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