刘阳/郑盼教授联合实验室报道CTLA-4抗体产生免疫相关副作用新机制

来源：iNature

编者按

2018年刘阳/郑盼联合实验室在Nature子刊Cell Research同时发表了两篇研究长文分别报道了抗CTLA-4抗体在肿瘤免疫治疗中的新机制和新模型。见iNature之前的报道“首次，2篇Cell Research背靠背发表，揭示肿瘤免疫治疗新突破”。第一篇文章对免疫检查点阻断理论提出了挑战。2011年伊匹单抗 Ipilimumab作为抗CTLA-4（细胞毒性T细胞相关抗原4）的单克隆抗体，被美国FDA批准用于治疗无法手术的晚期黑色素瘤患者，在临床上取得了不错的治疗效果，但其抗肿瘤机制一直存在争议。

刘阳和郑盼联合实验室通过详实的研究表明长久以来流行的抗CTLA-4抗体Ipilimumab在癌症免疫治疗中的免疫检查点阻断（checkpoint blockade）假说并不成立，即Ipilimumab并不是通过阻断CTLA-4/B7相互作用而发挥抗肿瘤效果，而是通过CTLA-4抗体介导的细胞杀伤或吞噬作用（ADCC/ADCP）选择性删除肿瘤内高表达CTLA-4的调节性T细胞（Treg）来增强T细胞的抗肿瘤效果，只有搞清楚了抗肿瘤的真正的主要机制才能进一步的开发第二代的CTLA-4抗体。第二篇文章中研究人员利用CTLA-4人源化的新生小鼠模型，成功模拟了临床上Ipilimumab单用以及联用造成的各个脏器的免疫副作用，并评估了其它抗CTLA-4抗体的安全性，为我们建立了一个评估肿瘤免疫治疗药物诱导的免疫相关副作用的模型，方便我们进一步的研究肿瘤免疫治疗药物产生副作用的机制，并开发筛选更安全更有效的CTLA-4抗体。

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虽然Ipilimumab在临床上取得了不错的治疗效果，但由于其反应率较低且副作用比较大，被临床上的后起之秀PD抗体（PD-1及配体PDL1/B7H1为靶标的抗体）追赶。如何提高抗CTLA-4抗体在肿瘤免疫治疗中的效果并减少其诱发的免疫副作用，一直是癌症免疫治疗中的一个难题。

2019年7月2日，Cell Research 在线发表了来自美国马里兰大学医学院刘阳/郑盼教授联合实验室在此领域的最新研究成果“Hijacking antibody-inducedCTLA-4 lysosomal degradation for safer and more effective cancer immunotherapy”，揭示了CTLA-4抗体产生免疫副作用的全新机制。

前期研究表明，伊匹单抗（Ipilimumab）与PD1抗体联合处理表达有人CTLA-4基因的年幼小鼠会产生严重的免疫相关副作用，而另外的CTLA-4抗体HL12或HL32联合PD1抗体并没有产生严重的副作用。之后实验室一直致力于探索CTLA-4抗体产生免疫相关副作用的机制。Tremelimumab是另外一种CTLA-4抗体，在多个临床试验中由于未达到预期终点且副作用比较严重而终止。研究人员为了方便和同为hIgG1亚型的Ipilimumab和HL12/HL32抗体比较，产生了human IgG1亚型的Tremelimumab（TremeIgG1），此TremeIgG1在CTLA-4基因人源化小鼠模型里同样具有严重的副作用。

刘阳和郑盼实验室发现伊匹单抗（Ipilimumab）和TremeIgG1处理的细胞会下调CTLA-4的表达，而HL12和HL32抗体并不会下调CTLA-4的表达。根据文献报道，CTLA-4敲除小鼠在3-4周大时由于严重的多器官自身免疫疾病表型而死亡。成年小鼠进行条件性敲除CTLA-4后也会导致自身免疫性疾病表型。另外临床上发现CTLA-4突变或LRBA基因（CTLA-4再循环所需基因）突变的病人也会产生自身免疫性疾病表型。这提示我们CTLA-4表达水平的下调可能是CTLA-4抗体产生免疫相关副作用的机制之一。

进一步研究发现具有免疫相关副作用倾向的CTLA-4抗体（Ipilimumab和TremeIgG1）通过溶酶体降解CTLA-4的方式来拮抗CTLA-4的功能，导致CTLA-4分子下调，而安全的CTLA-4抗体（HL12/HL32）却逃避了溶酶体的降解，保留了CTLA-4分子，促进了CTLA-4分子的再循环。具体是什么特性导致了不同CTLA-4抗体处理后CTLA-4迥异的命运，是降解还是再循环？

刘阳和郑盼组发现不同的CTLA-4抗体具有不同的pH敏感性，如图1a所示，副作用比较强的Ipilimumab和TremeIgG1对pH不敏感，即在溶酶体（lysosome）的酸性条件下（pH为4.5-5.5）仍然结合CTLA-4分子，进而进入溶酶体降解程序，降低细胞表面的CTLA-4分子的表达。而安全的HL12/HL32抗体对pH比较敏感，在酸性环境下不能结合CTLA-4分子，进而逃避溶酶体降解，CTLA-4分子通过再循环而回到细胞表面，维持细胞表面CTLA-4的表达。

研究人员打算用两种方式来证明这个假设，一是让安全的抗体变得不安全，二是让不安全的抗体变得更安全。

为了让安全的HL12/HL32抗体变得不安全，我们应该想法促使HL12/HL32下调CTLA4的表达。伯胺喹Primaquine（PQ）作为细胞内吞循环抑制剂,是一种用于治疗和预防疟疾以及治疗肺孢子虫肺炎的药物。刘阳和郑盼组研究人员发现，PQ通过阻断CTLA-4的动态再循环可以诱导HL12/HL32处理过的Treg细胞下调CTLA-4的表达。进一步的动物实验表明PQ确实可以让安全的HL12/HL32抗体产生比较严重的免疫相关的副作用。

为了让不安全的CTLA4抗体变得更加安全，研究人员改造了副作用更强的TremeIgG1抗体，得到了具有不同pH敏感性的突变体。如图1b-d所示，研究人员通过将TremeIgG1抗体的互补决定区CDR的酪氨酸Y突变成组氨酸H，成功地增加了TremeIgG1抗体的pH敏感性，阻止了抗体诱发的CTLA-4分子的溶酶体降解与下调，进一步的动物实验也表明改造后的抗体显著减少了免疫相关的副作用。

通过pH敏感性改造后，不安全的CTLA-4抗体变得安全了，那么是否影响了关键的抗肿瘤效果呢？如图2所示，研究人员发现pH敏感性改造后的抗体通过保留细胞表面的CTLA-4分子，增加了抗体介导的细胞杀伤作用，即更加有效的通过CTLA-4抗体介导的细胞杀伤或胞吞作用（ADCC/ADCP）选择性删除肿瘤微环境内高表达CTLA-4分子的调节性T细胞（Treg），进而增强机体对大肿瘤的抗肿瘤效果。通过pH敏感性改造后不仅减少了免疫相关的副作用，抗肿瘤效果也有一定程度的增加，可谓“一石二鸟”。

   这项最新的研究在肿瘤免疫治疗领域为我们提出了一个新概念，新思路。为了开发安全有效的CTLA-4抗体免疫治疗药物，我们应当保留而不是阻断CTLA-4这个“免疫检查点”，比如通过抗体改造增强其pH敏感性。

美国马里兰大学医学院的刘阳/郑盼实验室的项目负责人张燕博士以及杜雪相博士和刘明月博士为论文共同第一作者。同一实验室的唐飞博士，张鹏博士，艾春霞医生，人类病毒学研究所的James K.Fields, Eric J.Sundberg, Olga S Latinovic 以及昂科免疫生物技术有限公司（OncoImmune, Inc.）的Martin Devenport对这项研究也做出了重要贡献。

 参考信息：

1. Xuexiang Du*, Fei Tang*, Mingyue Liu, Juanjuan Su, Yan Zhang, WeiWu, Martin Devenport, Christopher A Lazarski, Peng Zhang, Xu Wang, Peiying Ye,Changyu Wang, Eugene Hwang, Tinghui Zhu, Ting Xu, Pan Zheng# & Yang Liu#. Areappraisal of CTLA-4 checkpoint blockade in cancer immunotherapy. Cell Res.2018;28(4):416-32. Epub 2018/02/24. doi: 10.1038/s41422-018-0011-0. PubMedPMID: 29472691.

2. Xuexiang Du*, Mingyue Liu*, Juanjuan Su, Peng Zhang, Fei Tang,Peiying Ye, Martin Devenport, Xu Wang, Yan Zhang, Yang Liu# & Pan Zheng#.  Uncoupling therapeutic from immunotherapy-relatedadverse effects for safer and effective anti-CTLA-4 antibodies in CTLA4humanized mice. Cell Res. 2018;28(4):433-47. doi: 10.1038/ s41422-018-0012-z.PubMed PMID: 29463898; PMCID: PMC5939041.

3. Yan Zhang*, Xuexiang Du*, Mingyue Liu*, Fei Tang, Peng Zhang,Chunxia Ai, James K. Fields, Eric J. Sundberg, Olga S. Latinovic, MartinDevenport, Pan Zheng# and Yang Liu#. Hijacking Antibody-induced CTLA-4Lysosomal Degradation for Safer and More Effective Cancer Immunotherapy.

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