韩硕等报道RNA测序新方法——检测亚细胞水平转录组空间分布

来源：BioArt

原标题：Cell新技术突破 | 韩硕等报道RNA测序新方法——检测亚细胞水平转录组空间分布

明确细胞中不同RNA的空间分布特征对于理解RNA的细胞功能及调控具有重要作用。特定RNA分子的非对称、不均匀分布与维持染色质三维结构，蛋白区域化翻译（local translation） ，组织发育等多种生命过程具有密切关系，所以在转录组层面系统研究分析RNA空间分布具有重要生物学意义【1】。

目前常用的手段包括经典的生化离心分层来获取各种细胞器，随后进行RNA测序（fractionation-seq）。但这种方法不仅容易引入很多杂质分子，而且仅限于可以被纯化的细胞器，很多重要细胞区域（比如核纤层、核孔、线粒体外膜等）都无法被有效提取。近年来发展的新型RNA荧光原位杂交成像技术 ，例如哈佛大学庄小威实验室发明的merFISH 【2】，可以同时获取单细胞中上千种RNA的空间信息，但这种基于探针杂交的手段无法像测序那样获取RNA全部序列信息，并且这类技术需要的复杂的自动化设备也无法普适于大多数实验室。因此，目前亟需一种在转录组层面，能对活细胞中各种类型RNA准确定位、具有高时空分辨率的测序方法。

2019年6月20日，来自斯坦福大学的化学生物学家Alice Ting教授和RNA生物学家Howard Chang教授及其团队在Cell杂志上合作发表了题为 Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq 的文章，Ting实验室的博士生韩硕与Chang实验室的博士后Furqan Fazal为论文的共同第一作者。

该工作发展了一种名为APEX-Seq的RNA测序技术，通过基因编码的过氧化氢酶APEX2在 H2O2催化1分钟后，直接在活细胞内对指定区域（利用特异性融合蛋白或定位信号将APEX定位在目标区域）的RNA进行高精度的生物素标记，然后利用链亲和素修饰的磁珠对标记的RNA进行富集后进行深度测序（图1）。基于这一方法，作者对包括细胞核、核孔、核纤层、核仁、细胞质、内质网外膜、内质网内膜、线粒体基质，线粒体外膜在内的9个亚细胞区域/结构的RNA组成进行了全面的分析，绘制了HEK293细胞内以这9个位置为坐标的转录组空间分布图谱，以及细胞在不同刺激下部分区域RNA分布的动态变化。

图 1. APEX-Seq技术的简单流程示意图

APEX （engineered ascorbate peroxidase）生物素标记是Alice Ting实验室发展的 “邻位标记” （proximity labeling）系列技术中一种重要的活细胞标记手段 【3】。用于蛋白组学的邻位标记在短短几年之内已成为研究细胞生物学和生物化学不可替代的重要方法，在解决亚细胞层面细胞器蛋白组成、蛋白-蛋白相互作用等基础问题上发挥着越来越核心的作用 【4】。因此作者设想是否可以把这种技术从蛋白质拓展到RNA层面。为此作者首先进行了细胞外以及活细胞内的APEX标记实验，通过dot-blot确认了APEX催化生物素酚类自由基可以直接与RNA发生化学反应，实现RNA的共价生物素标记。为了测试新建立的APEX-Seq方法，作者先将APEX定位到一些已知RNA组成的细胞区域，包括线粒体基质和内质网外膜（ERM），通过邻位标记测序成功富集了线粒体内相应的RNA，以及内质网外膜上编码外分泌蛋白的RNA，表明APEX-seq在封闭和开放细胞区域都具有极高的特异性和空间分辨率。

验证了APEX-Seq方法之后，接着将该方法推广到了上述9个细胞结构/区域，绘制了转录组的亚细胞空间分布图 （图2，注：由于线粒体基质区域内只有13个线粒体DNA编码的mRNA与2个rRNA，在数据分析中并没有包括这一区域，所以左图只有8列）。这个庞大的数据库既验证了许多过去对单个RNA研究总结得出的结论（比如大部分lncRNA都主要分布于细胞核中），又包含了很多以前未知的RNA空间信息。对于新的发现，作者通过离心分层测序和荧光成像两种经典的方法进行了交叉印证。

图2. 通过9个亚细胞区域APEX-seq得到的RNA空间分布图谱

为了进一步证明APEX-Seq数据可用以提出和检验新的生物学猜想，文章先后简单分析了同一RNA不同亚型（isoform）的差异分布，内含子滞留核内，m6A修饰与出核运输关系，以及细胞核内特殊RNA结构域分布等一系列问题，发现了很多有趣的RNA空间调控的规律。例如，反转录转座子相关的SINE和LINE序列在细胞核内的核纤层区域有最高的富集等等。最后，为了展示APEX-Seq极高的时间分辨率（1分钟标记）可用于研究RNA动态变化（图3），作者用4种不同小分子对活细胞进行了短暂干预（包括2种不同机理的蛋白翻译抑制剂，1种线粒体膜电位抑制剂和1种微管形成抑制剂），详细研究了参与线粒体外膜周围RNA定位的相关过程，以及微管抑制过程中RNA分布的变化过程。

图3. APEX-seq可以得到RNA在不同空间和时间的动态分布

总之，该文章发明了一种亚细胞层次转录组空间分布的RNA测序新方法APEX-Seq，具有极高的时间和空间分辨率，深度挖掘其产生的RNA分布图谱也可作为提出新的生物学猜想的源泉。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.027      

参考文献

1. Buxbaum, A.R., Haimovich, G., and Singer, R.H. (2015). In the right place at the right time: visualizing and understanding mRNA localization. Nat Rev Mol Cell Biol 16, 95-109.

2. Chen, K.H., Boettiger, A.N., Moffitt, J.R., Wang, S., and Zhuang, X. (2015b). Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science 348, aaa6090-aaa6090.

3. Lam, S.S., Martell, J.D., Kamer, K.J., Deerinck, T.J., Ellisman, M.H., Mootha, V.K., and Ting, A.Y. (2014). Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods 12, 51-54.

4. Rhee, H.W., Zou, P., Udeshi, N.D., Martell, J.D., Mootha, V.K., Carr, S.A., and Ting, A.Y. (2013). Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science 339, 1328-1331.