泛素连接酶RIPLET激活RIG-I信号的新模式

来源：BioArt

原标题：Cell | 泛素连接酶RIPLET激活RIG-I信号的新模式，否认了TRIM25在RIG-I泛素化修饰及信号激活中的作用

天然免疫是机体抵御病原微生物的入侵的第一道生理防线。病原入侵机体后，宿主天然免疫系统的模式识别受体（PRRs，pattern recognition receptors）识别病原体的病原相关分子模式（PAMPs，pathogen-associated molecular patterns），进而激活下游的信号通路接头蛋白，最终诱导I型干扰素（IFN）以及促炎因子的表达，进而促进抗感染免疫应答【1,2】。

在RNA病毒的入侵时，RIG-I（retinoic acid-inducible gene-I）能够识别胞质病毒RNA并产生I型干扰素（type I interferons，IFNs）及细胞因子【3】。RIG-I的分子结构中包含N端CARDs（caspase activation and recruitment domains， CARDs）结构域，DECH解旋酶结构域与C端CTD（C-terminal domain，CTD）结构域。

静息状态下的RIG-I处于自身抑制状态，其CARDs结构域结合于解旋酶结构域的插入区；当RNA病毒入侵后，CTD结构域感应并结合5’三磷酸双链RNA，使得RIG-I分子转变为开放构象释放CARDs结构域，释放的CARDs结构域会形成四聚体，并通过CARD-CARD相互作用招募MAVS成核(nucleate)，介导下游信号的激活和免疫应答【4】。

对RIG-I而言，63位赖氨酸泛素链（K63-Ubn chains）修饰在RIG-I的激活中发挥了重要作用。已有的报道指出，TRIM25和RIPLET(RNF135)是促进RIG-I信号激活中主要的泛素连接酶（E3 ligase），并且RIPLET和TRIM25以先后的顺序与RIG-I发生作用【5】。然而，对于RIPLET激活RIG-I的机制细节尚不清楚，同时TRIM25对RIG-I泛素化修饰及功能激活有待于进一步验证。

近日，来自美国哈佛医学院的Sun Hur课题组在Cell上发表题为Ubiquitin-Dependent and -Independent Roles of E3 ligase RIPLET in Innate Immunity的研究，研究人员通过细胞和生化的方法证明了RIG-I的泛素化修饰及激活依赖于RIPLET，同时否认了TRIM25在RIG-I泛素化修饰及信号激活中的作用。在与尚未形成RIG-I纤丝的“纤丝状寡聚体”结合时，RIPLET倾向于通过二聚体结构结合泛素化的RIG-I寡聚体；而对于形成纤丝的RIG-I，RIPLET则不依赖于泛素化方式，而是能够通过“搭桥”RIG-I纤丝，进一步放大RIG-I信号。

首先，研究人员通过基因敲除的293T细胞结合荧光素酶活性实验（luciferase activity assay）来研究RIPLET和TRIM25在RIG-I信号中的作用，结果发现RIPLET对于RIG-I信号激活是必需的。而在多种细胞（293T、MEF和A549）中，使用多种RIG-I配体（dsRNA、SeV、VSV、RVFV以及FluA）激活的结果表明TRIM25并不影响RIG-I的功能。

接下来，在RIG-I的63位泛素链修饰方面，通过体外泛素化实验（ubiquitination reaction in vitro）和体外MAVS激活实验（in vitro MAVS stimulation assay），研究人员发现在dsRNA存在的条件下，RIPLET能够将63位泛素链连接到RIG-I上，并且激活下游的MAVS形成纤丝（filament）结构。而在同样条件下，无论dsRNA存在与否，TRIM25都不能催化RIG-I发生泛素化修饰。

在分子机制上，为了探究RIPLET如何激活RIG-I，研究人员通过非变性凝胶迁移实验（native gel shift assays）结合截断体（truncation）实验，发现负责RIPLET二聚化的CC（central coiled coil）结构域对于结合RIG-I是必需的，并且该结合同时需要dsRNA的存在。这表明RIPLET通过二聚化的形式结合RIG-I。

为了进一步研究dsRNA的长度对于RIPLET与RIG-I的结合和泛素化修饰的关系。研究人员通过体外泛素化实验发现，只有在dsRNA长度大约为30–40 bp时，RIPLET泛素化修饰RIG-I的效率为最高。然而之前的报道指出，长度为40–200bp 的dsRNA更能有效的使RIG-I形成纤丝（filament）结构，进而引起RIG-I局部的高浓度，起到放大信号的作用【6】。因此，在长链dsRNA下，RIPLET与RIG-I的结合可能存在一种不依赖于泛素化修饰的机制。

为了探究这一机制，研究人员通过negative stain EM和生物素标记RNA捕获实验（biotin-RNA pull-down assay）发现，无论是在体内还是体外的实验中，在长链dsRNA（162bp和512bp）存在下，RIPLET能够以“交叉搭桥”（Cross-Bridge）的方式连接RIG-I纤丝，并且这一过程不依赖于应激颗粒（stress granules，SGs）的形成。进一步对此进行功能分析表明，RIPLET“搭桥”RIG-I纤丝与RIG-I发生的63位泛素链修饰都能够增强RIG-I信号的活性，并且两者呈现出显著的协同效应。

综上所述，研究人员通过体外的生化实验结合细胞实验，证实了能够催化RIG-I发生63位泛素链修饰的的泛素连接酶是RIPLET而不是TRIM25。RIPLET以二聚体的形式结合RIG-I，并且在的短链dsRNA条件下，RIPLET倾向于结合并泛素化纤丝状的RIG-I寡聚体；而在长链dsRNA条件下，RIPLET则不依赖于泛素化，而是通过“交叉搭桥”的方式连接RIG-I纤丝，激活下游信号。本研究的结果揭示了泛素连接酶在天然免疫信号调控中的新机制，为其它受体的调控机制提供了新思路。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.03.017

参考文献

1 Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell 2010; 140:805-820.

2 Hu MM, Shu HB. Cytoplasmic Mechanisms of Recognition and Defense of Microbial Nucleic Acids. Annual review of cell and developmental biology 2018; 34:357-379.

3. Hajishengallis, G., and Lambris, J.D. (2011). Microbial manipulation of receptor crosstalk in innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 187–200.

4 Wu, J.X., and Chen, Z.J. (2014). Innate Immune Sensing and Signaling of Cytosolic Nucleic Acids. Annu Rev Immunol 32, 461-488.

5 Oshiumi, H., Miyashita, M., Matsumoto, M., and Seya, T. (2013). A Distinct Role of Riplet-Mediated K63-Linked Polyubiquitination of the RIG-I Repressor Domain in Human Antiviral Innate Immune Responses. Plos Pathog 9.

6 Peisley, A., Wu, B., Yao, H., Walz, T., and Hur, S. (2013). RIG-I Forms Signaling-Competent Filaments in an ATP-Dependent, Ubiquitin-Independent Manner. Mol Cell 51, 573-583.